Agroinfiltration-Mediated Genetic Transformation for Transient Expression of Green Fluorescent Protein in The Rare Sumatran Orchid Paphiopedilum primulinum M. W. Wood & P. Taylor

Ahmad Yudis Mahardhika, Prof. Dr. Endang Semiarti, M.S., M.Sc.

2026 | Tesis | S2 Biologi

Paphiopedilum primulinum M. W. Wood & P. Taylor merupakan anggrek langka endemik Sumatra, Indonesia, yang berstatus kritis. Pendekatan bioteknologi modern diperlukan untuk meningkatkan efektivitas dan efisiensi perbanyakan klon P. primulinum dalam upaya konservasi, salah satunya melalui transformasi genetik. Agroinfiltrasi menjadi metode yang efisien untuk transfer gen dan dapat memunculkan ekspresi transien gen secara cepat pada transforman. Meskipun metode tersebut banyak diterapkan pada kondisi in vitro maupun ex vitro, penerapannya pada anggrek P. primulinum belum dilakukan.

Penelitian ini bertujuan untuk menentukan waktu deteksi T-DNA pada transforman; mengetahui efisiensi transformasi genetik; dan membuktikan bahwa metode agroinfiltrasi menggunakan Agrobacterium tumefaciens GV3101 yang membawa plasmid pRI 101-AN dengan konstruksi T-DNA P35S::GFP::Tnos – Pnos::NPTII::Tnos merupakan metode yang mudah dan efisien untuk deteksi cepat keberhasilan transfer T-DNA pada P. primulinum. Penelitian dilakukan melalui pengujian kemurnian A. tumefaciens; injeksi suspensi bakteri melalui nodus dengan variasi densitas (OD600 0,5 dan 0,8), Acetosyringone (AS) (0 dan 200 µM), dan volume suspensi (50 dan 100 µl); pengamatan ekspresi transien gen reporter GFP pada daun; serta deteksi kandidat transforman secara molekuler. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekspresi transien gen GFP dapat terdeteksi sejak hari ke-1 setelah injeksi, dengan efisiensi transformasi sebesar 100% di seluruh perlakuan. Kombinasi perlakuan volume suspensi 100 µl tanpa AS di semua densitas bakteri menghasilkan intensitas pendaran tertinggi 1,269 (a.u.) pada OD600 0,5 dan 1,229 (a.u.) pada OD600 0,8. Deteksi cepat keberhasilan transformasi genetik dapat dilakukan dengan mudah dan efisien, sehingga berpotensi menjadi platform yang menjanjikan bagi studi fungsi gen dan pengembangan bioteknologi berorientasi konservasi pada berbagai jenis anggrek langka.

Paphiopedilum primulinum M. W. Wood & P. Taylor is a Critically Endangered (CR) endemic orchid of Sumatra, Indonesia. Modern biotechnological approaches, including genetic transformation, are necessary to enhance the effectiveness and efficiency of clonal propagation for P. primulinum conservation. Agroinfiltration is an efficient method for gene transfer and enables rapid transient gene expression. Although it has been widely applied under in vitro and ex vitro, its application in P. primulinum has not been reported.

The objectives of this research were to determine the time required for T-DNA detection in transformant; determine the transformation efficiency; and demonstrate that agroinfiltration using Agrobacterium tumefaciens GV3101 carrying the pRI 101-AN plasmid with the T-DNA construct P35S::GFP::Tnos–Pnos::NPTII::Tnos is a reliable and efficient method for rapid detection of successful T-DNA transfer in P. primulinum. The research examined testing the purity of A. tumefaciens; nodal injection of bacterial suspension under various bacterial density (OD600 0.5 and 0.8), Acetosyringone (AS) (0 and 200 µM), and suspension volume (50 and 100 µl); followed by observation of transient GFP reporter gene expression in leaf tissues and molecular detection of transformant candidates. Transient GFP gene expression was clearly observed from day 1 post-injection, with 100% transformation efficiency across all treatments. The combination of a 100 µl suspension volume without AS at all bacterial densities resulted in the highest fluorescence intensities, reaching 1.269 (a.u.) at OD600 0.5 and 1.229 (a.u.) at OD600 0.8. These results demonstrate a rapid and efficient approach for functional gene analysis and conservation-oriented biotechnology in rare orchids.

Kata Kunci : Agrobacterium tumefaciens, Agroinfiltrasi, GFP, Paphiopedilum primulinum, Transformasi