ISOLASI, KLONING DAN ANALISIS IN SILICO OPEN READING FRAME (ORF) ASETIL XILAN ESTERASE DARI Bacillus subtilis SBT8

YULIANA HASTIN S, M. Saifur Rohman, S.P., M.Si., M.Eng., Ph.D.; Prof. Ir. Triwibowo Yuwono, Ph.D.; Widhi Dyah Sawitri, S.Si., M.Agr., Ph.D.

2020 | Skripsi | S1 MIKROBIOLOGI PERTANIAN

Xilan merupakan polimer yang sulit didegradasi karena memiliki gugus asetil pada rantai sampingnya sehingga diperlukan dua proses pemotongan yaitu pemotongan gugus asetil dan pemotongan ikatan Beta (1,4)-D-xilanopiranosil. Pemotongan rantai samping pada xilan dapat dilakukan oleh enzim asetil xilan esterase (AXE). Pada penelitian ini dilakukan isolasi, kloning dan analisis in silico open reading frame (ORF) AXE Bacillus subtilis SBT8 untuk mengetahui struktur dan karakter enzim tersebut. Setelah ORF AXE diisolasi dari genom Bacillus subtilis SBT8 kemudian dilakukan kloning menggunakan plasmid pET28a dan hasil konstruksi gen ditransformasikan ke dalam E.coli BL21 (DE3). Hasil positif ditunjukan dengan terbentuknya pita DNA berukuran ± 940 bp pada hasil PCR koloni. Analisis in silico ORF AXE dilakukan dengan menggunakan BLAST, ExPASy ProtParam, MEGA X, SWISS MODEL, dan PyMOL 2.2.3. Berdasarkan hasil ExPASy ProtParam diketahui ORF AXE Bacillus subtilis SBT8 memiliki panjang sekuen 313 asam amino dengan rasio asam amino basa/asam sebesar 1,333, rasio arginin/lisin yang beperan pada termostabilitas protein sebesar 0,55; serta rasio glisin/prolin yang berperan pada pembentukan konformasi protein sebesar 1,35. Analisis struktur menunjukan ORF AXE Bacillus subtilis SBT8 memiliki bentuk topologi Alfa/Beta/Alfa sandwich seperti AXE pada famili karbohidrat esterase 7 lainnya. Terdapat triad katalitik pada ORF AXE Bacillus subtilis SBT8 yaitu S175, D263, dan H292 yang serupa dengan cephalosporin C deasetilase Bacillus subtilis 168 (1ODS) dan asetil xilan esterase Bacillus pumilus (3FVT). Penelitian diharapkan dapat menjadi studi awal mengenai ORF asetil xilan esterase dan proses konstruksi gen tersebut ke dalam plasmid pET28a.

Xylan is a polymer that is difficult to degrade as it has an acetyl group in its side chain, therefore it requires two cutting processes at acetyl groups and Beta (1, 4)-D-xylanopiranosil bonds. Side chain cutting in xylan can be done by the enzyme acetyl xylan esterase (AXE). This study discussed the isolation, cloning and in silico analysis of open reading frame (ORF) AXE of Bacillus subtilis SBT8 to determine the structure and character of the enzyme.Following ORF AXE isolation from the Bacillus subtilis SBT8 genome, cloning was carried out using plasmids pET28a. The recombinant DNA was then transformed into E. coli BL21 (DE3). Positive results were shown by the formation of DNA bands of ± 940 bp from PCR colony. In silico analysis of ORF AXE was performed using BLAST, ExPASy ProtParam, MEGA X, SWISS MODEL, and PyMOL 2.2.3. Based on the results of the ExPASy ProtParam it is known that ORF AXE Bacillus subtilis SBT8 has a sequence length of 313 amino acids with a ratio of basic/acidic amino acid acid of 1.333, an arginine/lysine ratio which is have role in protein thermostability of 0.55; and the glycine/proline ratio which plays role in the conformation of protein of 1.35. Structural analysis showed that ORF AXE Bacillus subtilis SBT8 has the Alpha/Beta/Alpha sandwich topology like AXE on other carbohydrate esterase 7 families. The catalytic triad of AXE Bacillus subtilis SBT8 consists of S175, D263, and H292 which are similar to cephalosporin C deacetylase Bacillus subtilis 168 (1ODS) and acetyl xylan esterase Bacillus pumilus (3FVT). This research is expected to be an early study of ORF acetyl xylan esterase and the construction process of such gene into the pET28a plasmid.

Kata Kunci : analisis in silico, asetil xilan esterase, Bacillus subtilis SBT8, kloning