REKAYASA GENOM ANGGREK Dendrobium capra J.J. Smith, Dendrobium lineale Rolfe dan Dendrobium macrophyllum A. Rich DENGAN METODE CRISPR/Cas9

YULI SETIAWATI, Dr. Endang Semiarti, MS., M.Sc

2019 | Tesis | MAGISTER BIOLOGI

Dendrobium merupakan genus pada suku Orchidaceae yang memiliki jumlah ±1600 jenis yang tersebar di dataran Asia Tenggara dan Australia dan 275 jenis diantaranya dapat ditemukan di Indonesia. Saat ini masih terdapat dua permasalahan utama pada anggrek yaitu, rendahnya produksi tanaman dan masih memerlukan waktu yang lama untuk berbunga. Oleh karena itu dibutuhkan suatu pendekatan untuk memecahkan permasalahan tersebut. Penyuntingan genom menggunakan CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-Associated-9) metode presisi dalam bidang biologi molekuler yang mampu menginduksi rusaknya untai ganda DNA pada sekuens dengan motif spesifik. Namun, sebelum menggunakan gen fungsional untuk pertunasan dan pembungaan maka pada penelitian ini digunakan gen kloroplas, VARIEGATED 2 (VAR2). Gen ini akan digunakan sebagai gen indikator keberhasilan metode CRISPR/Cas9 pada genom Dendrobium. Tujuan penelitian ini ialah untuk mendapatkan metode yang paling optimum dalam mengintroduksi plasmid pRGEB32 pembawa T-DNA Ubi::Cas9::U3::VAR2 dengan metode transformasi melalui perantara Agrobacterium pada tiga spesies Dendrobium yaitu, D. capra, D. lineale dan D. macrophyllum. Sebagai pra-penelitian telah dilakukan pengecekan sensitifitas protokorm umur 8 minggu dan planlet umur 16 minggu pada media seleksi yang ditambahkan antibiotik hiromisin konsentrasi 0;2;4;6;8 dan 10 mg/L. Kemudian, pada penelitian juga dilakukan perendaman protokorm pada waktu yang berbeda yaitu: 0;15;30 dan 45 menit dalam kultur Agrobacterium untuk mendapatkan nilai efisiensi yang paling tinggi. Selanjutnya dilakukan pengecekan pemanfaatan eksplan berupa planlet yang dilukai dengan cara ditusuk pada bagian bulb dan dipotong ujung daun pertama dan keduanya. Hasil yang didapatkan setiap spesies memiliki sensitifitas terhadap antibiotik higromisin yang berbeda. Pada D. lineale 10 mg/L dan D. macrophyllum 6 mg/L. Namun, planlet ketiga jenis anggrek sensitive pada konsentrasi 10 mg/L. Selanjutnya, waktu inokulasi 15 menit waktu optimum untuk mendapatkan efisiensi 0.66% pada D. macrophyllum dan 45 menit untuk mendapatkan efisiensi transformasi 1.16% pada D. lineale. Planlet dapat dijadikan target eksplan untuk transformasi genetik dengan perantara Agrobacterium. Secara fenotip, terdapat perubahan warna dan adanya pertumbuhan yang berbeda antara tanaman nontransforman dan transforman D. capra, D. lineale dan D. macrophyllum. Secara genotipik, terdapat subsitusi pada bagian target site gen VAR2 pada D. lineale dan D. macrophyllum sedangkan pada D. capra tidak didapatkan perubahan.

Dendrobium is a genus in the Orchidaceae family which has number of ± 1600 species spread across Southeast Asia and Australia and 275 of Dendrobium can be found in Indonesia. Currently, there are two main problems with orchids, namely, low production of plants and still require a long time to flower. Therefore, we need an approach to solve this problem. Genome editing using CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-Associated-9) is precision methods in the field of molecular biology that is able to induce damage to double strands of DNA in sequences with specific motifs. However, before using functional genes for budding and flowering, this study used the chloroplast gene, VARIEGATED2 (VAR2), which will be used as an indicator gene for the success of the CRISPR/Cas9 method in the Dendrobium genome. The purpose of this study was to obtain the most optimum method for introducing plasmid pRGEB32 T-DNA carried Ubi::Cas9::U3::VAR2 by using Agrobacteriumin-mediated transformation in, D. capra, D. lineale and D. macrophyllum. As a pre-eliminary, the sensitivity of 8-weeks-old protocorm and 16-weeks-old plantlet in the selection media were added with antibiotic higromycin concentration of 0, 2, 4, 6, 8 and 10 mg/L. Then, the study also carried out immersion protocorm at different times, namely: 0, 15, 30 and 45 minutes in Agrobacterium culture to get the highest value of efficiency. Next, we checked explants in the form of plantlets that have been injured by stabbed in the bulb part and cut off the tip of the first and second leaf. The results obtained for each species have sensitivity to different hygromycin antibiotics. At D. lineale 10 mg/L and D. macrophyllum 6 mg/L. However, plantlet of three species was sensitive to a concentration of 10 mg/L. Furthermore, the inoculation time 15 mins was optimum time to get efficiency 0.66% at D. macrophyllum and 45 minutes to get transformation efficiency 1.16% at D. lineale. Planlets can be used as texplants for genetic transformation with Agrobacterium. Phenotypically, there was a change in color and the presence of different growth between non-transformation plants and transformants D. capra, D. lineale and D. macrophyllum. Genotypically, there was a substitution at the target site of the VAR2 gene site in D. lineale and D. macrophyllum while in D. capra there was no change.

Kata Kunci : CRISPR/Cas9, Dendrobium, transformasi genetik, varigata