OPTIMASI METODE MULTIPLEX PCR UNTUK DETEKSI INFEKSI Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura dan Necator americanus PADA TINJA AWETAN

CHRISTIANE MARLENE S, dr. Elsa Herdiana M., M.Kes., Ph.D.; Dr. drh. Sitti Rahmah Umniyati, SU

2019 | Tesis | MAGISTER ILMU BIOMEDIK

Latar Belakang. Multiplex PCR merupakan metode molekular yang dapat dipergunakan untuk deteksi infeksi cacing sekaligus dalam satu reaksi. Tahap- tahap optimasi terhadap semua komponen yang terlibat dalam proses deteksi menggunakan multiplex PCR perlu dilakukan untuk mendapatkan hasil deteksi yang tepat. Studi yang dilakukan ini dilakukan untuk deteksi infeksi Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura dan Necator americanus pada sampel tinja yang telah disimpan selama 3 tahun. Optimalisasi dilakukan baik selama ekstraksi DNA maupun selama tahap amplifikasi. Tujuan Penelitian. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menemukan kondisi yang optimal untuk mendeteksi infeksi A.lumbricoides, T.trichiura dan N.americanus dalam feses yang diawetkan menggunakan metode multiplex PCR selama ekstraksi DNA maupun pada tahap amplifikasi. Metode Penelitian. Sebanyak 15 sampel tinja yang diawetkan STH positif menggunakan mikroskop dianalisis untuk mendeteksi infeksi A.lumbricoides, T.trichiura dan N.americanus menggunakan metode multiplex PCR. Optimasi dilakukan selama proses ekstraksi dan amplifikasi DNA. Hasil. Mendapatkan DNA yang cukup dari telur Soil Transmitted Helminth dari feses membutuhkan beberapa langkah termasuk homogenisasi menggunakan beat beater dan dengan cepat melewatkan sampel pada Nitrogen cair diperlukan terutama untuk T.trichiura dari minimal 200 mg sampel feses yang diawetkan. Campuran PCR optimal dari beberapa PCR menggunakan gen COI target utama untuk A. lumbricoides, 18S rDNA untuk T.trichiura dan ITS1 untuk N.americanus adalah 15mcgl dari Go Taq Green Master Mix, 5mcgl dari 3 pasang primer, 5 mcgl template DNA dan 4 mcgl Dd H2O, dan kondisi PCR optimal adalah 30 menit denaturasi pada suhu 95 derajat C, 30 detik pada suhu 53 derajat C untuk proses aniling dan 1 menit ekstensi pada suhu 72derajat C, diulang 35 siklus. Kesimpulan. Multiplex PCR dapat dioptimasi untuk mendiagnosis STH isolat Indonesia. Keberhasilan pendeteksian infeksi Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura dan Necator americanus menggunakan metode multiplex PCR dipengaruhi oleh preparasi sampel sebelum isolasi DNA dilakukan, yang meliputi beberapa tahapan antara lain homogenisasi sampel menggunakan bead beater, serta melewatkan sampel pada nitrogen cair.

Background. Multiple PCR to detect Soil Transmitted Helminth Infection is one the most effective molecular detection of worm infection in stool samples, since in one run many worm infection can be detected. To ensure the assay work properly, optimization of each component involved in the species detection are essential. In the current study this method will be used to detect Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura and Necator americanus infection in stool sample that has been preserved for 3 years. Optimization were done both during DNA extraction as well as during amplification stage. Objective. The objective of the study is to find the optimal condition to detect A.lumbricoides, T.trichiura and N.americanus infection in preserved stool using multiple PCR both during DNA extraction as well as amplification stage. Methods. A total of 15 preserved stool sample STH positive using microscopy were analyzed to detect A.lumbricoides, T.trichiura and N.americanus infection using multiple PCR. Optimization were done during DNA extraction and amplification processes. Result. In order to get sufficient DNA from Soil Transmitted Helminth eggs from the stool, several steps included homogenization using beat beater and rapidly passing the sample on liquid Nitrogen are needed especially for T.trichiura from a minimum of 200 mg of preserved stool sample. The optimal PCR mixture of the multiple PCR using premier targeted COI gene for A.lumbricoides, 18S rDNA for T.trichiura and ITS1 for N.americanus are 15 mcgl of Go Taq Green Master Mix, 5 mcgl of the 3 pair of primer, 5 mcgl of DNA template and 4 mcgl of Dd H2O, and the optimal PCR condition are 30 minutes of 950C denaturation, 30 second of 530C annealing and 1 minute of 720C extension, repeated 35 cycles. Conclusion. Multiplex PCR can be optimized to diagnose STH of Indonesian isolates. The success of the detection of Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura and Necator americanus infection using the multiplex PCR method was influenced by sample preparation before DNA isolation, which included several steps including homogenization of samples using bead beaters, and passing samples on liquid nitrogen rapidly.

Kata Kunci : Optimasi, multiplex PCR, Soil Transmitted Helminth, Optimization, multiplex PCR, Soil Transmitted Helminth