Identifikasi dan analisis genetik bakteri karang pendegradasi senyawa herbisida 2,4-diklorofenoksi asetat di laut Jawa

SABDONO, Agus, Promotor Prof.Dr.Ir. Joedoro Soedarsono

2001 | Disertasi | S3 Ilmu Sains dan Teknologi

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengisolasi, menyeleksi, dan mengidentifikasi bakteri karang yang mampu mendegradasi senyawa herbisida 2,4-Diklorofenoksi asetat (2,4-D), serta menganalisis gen yang bertanggung jawab pada mekanisme degradasi. Survei di lapangan dilakukan dengan penyelaman scuba untuk mengetahui kondisi ekologis, kondisi karang, serta penentuan lokasi sampling. Studi ekotoksisitas dilakukan dengan menganalisis kandungan 2,4-D pada jaringan karang dan dilanjutkan dengan uji toksisitas senyawa 2,4-D terhadap karang. Studi degradasi senyawa 2,4-D oleh bakteri yang berasosiasi dengan karang dilakukan dengan isolasi bakteri dan jaringan karang, purifikasi, uji degradasi, uji sensitivitas, dan kinetika pertumbuhan dan penggunaan senyawa 2,4-D. Studi filogenetik molekuler meliputi ekstraksi DNA, amplifikasi DNA, RFLP, sequencing gen 16S rRNA, dan analisis homologi dengan menggunakan program BLAST dan RDP database. Konstruksi pohon filogenetik dilakukan dengan metode neighbour-joining CLUSTAL W dan program PHYLIP untuk menyusun matrik jarak dan fenogram. Isolasi plasmid dilakukan dengan menggunakan PFGE. Curing plasmid dilakukan dengan menggunakan acridine orange dan transformasi plasmid DNA dilakukan dengan elektrotransformasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kondisi karang di perairan pantai utara laut Jawa dalam keadaan rusak. Hasil analisis kandungan 2,4-D pada jaringan karang menunjukkan kemungkinan mortalitas karang disebabkan oleh efek senyawa tersebut. Percobaan toksisitas di laboratorium menunjukkan bahwa senyawa 2,4-D dapat membunuh karang. Hasil uji degradasi dengan menggunakan indikator media EMBA menunjukkan bahwa dan 187 isolat, hanya 59 isolat diantaranya mampu mendegradasi senyawa 2,4-D. Isolat KP108, JG101, CP107, PP202 dan PG303 diseleksi berdasarkan hasil yang diperoleh dari uji sensitivitas dan uji degradasi. Studi kinetika pertumbuhan dan penggunaan senyawa 2,4-D menunjukkan keragaman parameter kinetik dengan isolat PP202 memiliki daya degradasi yang paling tinggi. Penelitian kinetika isolat PP202 menunjukkan Linearisasi Lineweaver-Burk terhadap persamaan Michaelis-Menten Y= 1,3867 + 0,0653 X dengan laju pertumbuhan maksimum (Arnaks) sebesar 0,72 jam"' dengan konsentrasi penjenuhan (Ks) sebesar 47,09 mg/1 2,4-D. Laju penggunaan senyawa 2,4-D tertinggi (rs) sebesar 0,0806 g/l/jam dan laju penggunaan 2,4-D spesifik (a) sebesar 0,027 jam"' terjadi pada konsentrasi 200 mg/1 2,4-D. Analisis RFLP menunjukkan adanya 3 genotip (Operational Taxonomy Unit) yang berbeda, isolat KP108, JG101 dan PP202 memiliki pola restriksi yang sama (genotip I), isolat PG303 (genotip II) dan isolat CP107 (genotip Determinasi secara molekuler menggunakan analisis gen 16S rRNA menunjukkan isolat PP202 memiliki kesamaan tertinggi dengan Vibrio natriegens (96%), isolat PG303 memiliki kesamaan tertinggi dengan Vibrio alginolyticus (98%), dan isolat CP107 memiliki kesamaan tertinggi dengan Pseudoalteromonas gracilis (96%). Berdasarkan hasil analisis molekuler dan karakteristik mikrobiologis, diperkirakan bahwa isolat PP202 merupakan Vibrio natriegens strain PP202, isolat PG303 merupakan Vibrio alginolyticus strain PG303, dan isolat CP107 merupakan Pseudoalteromonas gracilis strain CP107. Hasil analisis genetik (PFGE, curing dan transformasi) menunjukkan bahwa Vibrio natriegens strain PP202 memiliki plasmid yang bermigrasi pada sekitar 945 kbp didasarkan pada marker linear molecular weight dan bertanggung jawab pada mekanisme degradasi senyawa 2,4-D.

The purposes of this study are to isolate, select, and identify the bacteria associated with corals, which are competent at degrading 2,4-Dichlorophenoxy acetate (2,4-D) compounds, and to analyze the gene, which are responsible for 2,4-D-degrading mechanism. The ecological and coral conditions and sampling sites selection are surveyed by scuba diving. The detection of 2,4-D herbicide residues in the tissues of dying corals is assayed, and the assay is continued on controlled toxicity experiments testing 2,4-D compounds on corals. The study of 2,4-D degradation on bacteria associated with corals is conducted by isolating the bacteria from coral tissues, purifying, performing degradation test, sensitivity test and kinetic study of growth and 2,4-D utilization. Molecular phylogenetic studies including DNA extraction, DNA amplification, RFLP, sequencing of 16S rRNA, and homology analyses by BLAST and RDP database program, are conducted. A phylogenetic-tree is constructed from the distance matrix by using CLUSTAL W. neighbour-joining method and PHYLYP program. Isolation of plasmid is done by PFGE. Curing plasmid is done by acridine orange treatment, and transformation is carried out by electrotransformation. The result showed that the coral condition on the Java Sea is very poor. Analysis of 2,4-D from coral tissues showed that the compound might cause coral mortality. In addition, the ecotoxicity study revealed that 2,4-D can kill coral on low concentration for brief exposure. Among 187 bacterial isolates, only 59 isolates are able to degrade 2,4-D compounds on EMBA indicator media. KP108, CP107, JG101, PP202 and PG303 isolates are selected based on the results of the sensitivity test and degradation test. Growth kinetics and 2,4-D substrate depletion experiment showed that the five isolates posses diverse kinetic parameters. Of the 5 isolates, PP202 has the highest capability of 2,4-D degradation. Lineweaver-Burk Linearization of the Michaelis-Menten equation is obtained Y = 0.0653 X + 1.3867 with maximum growth rate (gat) of 0.72 WI, with saturated concentration (Cs) of 47.09 mg/1 2,4-D. The effect of 2,4-D concentration on the substrate removal rate (rs) is 0.0806 g/l/h and the specific substrate removal rate (o) is 0.027 WI obtained from 200 mg/1 2,4-D concentration. RFLP analysis resulted in 3 genotype difference OTU (Operational Taxonomy Unit): KP108, JG101 and PP202 isolates having similar restriction pattern (genotype I), PG303 isolate (genotype II) and CP107 isolate (genotype III). Molecular determination of 16S rRNA analyses and microbiological characteristic revealed that PP202 isolate is assigned to Vibrio natriegens (96 %), PG303 isolate is assigned to Vibrio alginolyticus (98 %) and CP107 isolate was assigned to Pseudoalteromonas gracilis (96 %). Based on the the results of molecular analyze and microbial characteristics, PP202 isolate may be Vibrio natriegens strain PP202, PG303 isolate may be Vibrio alginolyticus strain PG303, and CP107 isolate may be Pseudoalteromonas gracilis strain CP107. Curing and transformation studies showed that PP202 isolate carries a plasmid, which contains the 2,4-D metabolic genes. The plasmid migrates at the position of linearized molecular marker of approximately 945 kb in size.

Kata Kunci : 2,4-D, degradasi, bakteri karang, RFLP, pohon filogenetik, degradation, coral bacteria, RFLP, phylogenetic-tree