Amplifikasi dan Karakterisasi ORF062L ISKNV pada Megalocytivirus

AMIQATUL FIKRIYAH, Dr. Ir. Murwantoko, M.Si.; Prof. drh. Widya Asmara, SU., Ph.D.

2015 | Tesis | S2 Bioteknologi

Megalocytivirus merupakan genus terbaru dalam famili Iridoviridae yang menyebabkan kematian dan kerugian ekonomi yang signifikan pada budidaya perikanan. Infectious spleen and kidney necrosis virus (ISKNV) merupakan salah satu klaster dari Megalocytivirus yang paling banyak menginfeksi ikan budidaya di Indonesia. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari variasi genetik dan mengevaluasi potensi open reading frame 62 (ORF062L) pada genom ISKNV sebagai penanda diagnostik pada infeksi Megalocytivirus. Dalam penelitian ini dilakukan isolasi DNA virus dari 9 isolat ikan yang berasal dari beberapa daerah di Indonesia. Deteksi dan amplifikasi ORF062L ISKNV dilakukan dengan teknik polymerase chain reaction (PCR). Deteksi isolat positif Megalocytivirus menggunakan primer spesifik OIE M1. Isolat positif Megalocytivirus digunakan sebagai template DNA untuk mengamplifikasi sekuen utuh ORF062L menggunakan 4 pasang primer yang dirancang dapat mengamplifikasi 4 fragmen gen berbeda dan saling bersinggungan. Hasil pembacaan sekuen dianalisis dan dibandingkan dengan sekuen database pada National Center for Biotechnology Information (NCBI). Prediksi putatif epitop sel T dan sel B dilakukan berdasarkan metode T cell epitope prediction nHLAPred (Compred) dan B cell epitope prediction tools pada immune epitope database (IEDB). Hasil identifikasi menunjukkan 6 dari 9 isolat positif Megalocytivirus. Analisis sekuen ORF062L dari 4 isolat Indonesia menunjukkan kemiripan 99,86-100% dengan spesies ISKNV. ORF062L berfungsi mengkode viral protein 62 (VP62) yang terdiri dari 1209 aa dan merupakan bagian dari DNA binding protein yang dapat dikenali sebagai epitop oleh sel T maupun sel B berdasarkan analisis secara in silico. ORF062L ISKNV merupakan gen yang konservatif sehingga dapat digunakan sebagai penanda (marker) diagnostik pada infeksi Megalocytivirus.

Megalocytivirus is a newly defined genus of Iridoviridae that caused high mortality and significant economic losses in aquaculture. Infectious spleen and kidney necrosis virus (ISKNV) is a cluster of Megalocytivirus that most widely infect fish in Indonesia. This research objectives are to study genetic variation and evaluate the potential of the 62th open reading frame (ORF062L) of ISKNV as a diagnostic marker in Megalocytivirus infection. DNA virus was isolated from 9 different fishes from several regions in Indonesia. Detection and amplification of ORF062L ISKNV were conducted by polymerase chain reaction (PCR) technique. Detection of Megalocytivirus was conducted using OIE M1 primer set. Megalocytivirus positive isolates used as the template to amplify full sequences of ORF062L using 4 sets of designed primers to amplify four different overlapping gene fragments. Nucleotide sequences of each fragment were analyzed and compared to database sequences at The National Center for Biotechnology Information (NCBI). Prediction of T-cells and B-cells putative epitopes was done by T cell epitope prediction nHLAPred (compred) and B cell epitope prediction tools in the Immune Epitope Database (IEDB). Identification results showed 6 of 9 isolates are Megalocytivirus positive. Sequence analysis of ORF062L ISKNV from 4 Indonesian isolates showed 99.86-100% similarity with ISKNV species. ORF062L encoding viral protein 62 (VP62), a DNA binding protein that consists of 1209 aa and can be recognized as epitopes by T cells and also B cells based on in silico analyses. ORF062L ISKNV is a highly conserved gene, therefore, this gene can be used as a diagnostic marker of Megalocytivirus infection.

Kata Kunci : DNA binding protein, in silico epitop, ORF062L ISKNV, Megalocytivirus, marker diagnostik