Induksi Embriogenesis Somatik Tanaman Anggrek Phalaenopsis "Sogo Vivien" dengan Zat Pengatur Tumbuh dan Transformasi Genetik

PAULINE D KASI, Dr. Endang Semiarti, M.S., M.Sc

2015 | Tesis | S2 Biologi

Phalaenopsis "Sogo Vivien" merupakan salah satu anggrek hibrida hasil persilangan Phalaenopsis "Sogo Alice" X Phalaenopsis "Zuma's Pixie" yang memenuhi kriteria sebagai tanaman hias dalam pot karena berukuran mini, memiliki bunga serta percabangan infloresensia yang banyak. Produksi massal dalam waktu yang cepat, serta menghasilkan anakan anggrek yang identik dengan induknya dibutuhkan untuk memenuhi permintaan pasar. Embriogenesis somatik merupakan teknik mikropropagasi in vitro yang dapat menghasilkan anakan yang seragam dalam jumlah besar. Induksi embriogenesis somatik dapat dilakukan dengan bioteknologi melalui perlakuan zat pengatur tumbuh (ZPT) dan transformasi genetik dengan penyisipan gen kunci pembentuk embrio pada tanaman. Penelitian ini dibagi dalam dua tahap: 1) Induksi embriogenesis somatik pada eksplan daun P. "Sogo Vivien" secara in vitro dengan menggunakan ZPT Thidiazuron (TDZ) (0,5 dan 10 mg/l) yang dikombinasikan dengan Naphtalene Acetic Acid (NAA) 1 mg/l; 2) Induksi embriogenesis somatik melalui transformasi genetik penyisipan gen AtRKD4 dalam konstruksi 35S::GAL4::AtRKD4::GR dengan mediasi Agrobacterium tumefaciens pada protokorm anggrek umur 16 hari setelah penaburan (hsp). Transformasi genetik diikuti dengan sistem induksi glukokortikoid menggunakan Dexamethasone (DEX) pada konsentrasi 10, 20 atau 40 mikromolar (uM) selama 1 atau 2 minggu. Konfirmasi keberhasilan integrasi gen AtRKD4 pada genom kandidat transforman dilakukan dengan amplifikasi gen AtRKD4 pada genom anggrek melalui direct PCR menggunakan primer spesifik AtRKD4. Hasil penelitian menunjukkan bahwa TDZ 10 mg/l yang dikombinasikan dengan NAA 1 mg/l mampu menginduksi pembentukan embrio somatik secara langsung pada eksplan daun anggrek P. "Sogo Vivien" in vitro. Efisiensi pembentukan embrio somatik yang diperoleh adalah 5,7% dengan jumlah embrio somatik yang terbentuk adalah 57 embrio dari 1 eksplan daun. Induksi embriogenesis somatik dengan transformasi genetik menggunakan gen AtRKD4 dalam konstruksi 35S::GAL4::AtRKD4::GR menghasilkan jumlah total tunas sebanyak 47 tunas dari 14 protokorm kandidat transforman. Protokorm kandidat transforman terbanyak diperoleh dari perlakuan induksi DEX 10 uM selama 1 minggu (80%) sedangkan jumlah embrio somatik dan tunas terbanyak diperoleh dari perlakuan induksi DEX 40 uM selama 2 minggu yang menghasilkan 13 tunas. Konfirmasi keberhasilan integrasi gen AtRKD4 pada genom anggrek P. "Sogo Vivien" dibuktikan dengan hasil PCR menunjukkan semua protokorm kandidat transforman positif membawa transgen AtRKD4 dengan ukuran pita DNA 268 bp. Efisiensi transfer gen AtRKD4 pada anggrek P. "Sogo Vivien" sebesar 0.04%. Dari keseluruhan hasil yang diperoleh dapat disimpulkan bahwa embrio somatik dapat diinduksi pada eksplan daun dan protokorm anggrek P. "Sogo Vivien" dengan ZPT TDZ dan insersi gen AtRKD4 dengan transformasi genetik melalui Agrobacterium tumefaciens.

Phalaenopsis "Sogo Vivien" is one of the Phalaenopsis orchid hybrids from crosses of Phalaenopsis "Sogo Alice" X Phalaenopsis "Zuma's Pixie" which meet the criteria as ornamental potted plants because of its mini-sized, with many flowers and inflorescences. Mass propagation in a short time, and producing seedlings which are identical to the parental, are needed to meet the market demand. Somatic embryogenesis is one of in vitro micropropagation techniques which can be used to produce uniform seedlings in large numbers. Induction of somatic embryogenesis can be done through application of plant growth regulator and genetic transformation by inserting a key gene involves in embrio induction. This research was divided into two stages: 1) Induction of somatic embryogenesis from P. "Sogo Vivien" in vitro leaf explants using Thidiazuron (0, 5 and 10) mg/l combined with Naphtalene Acetic Acid of 1 mg/l; 2) Induction of somatic embryogenesis through Agrobacterium-mediated genetic transformation, by insertion of AtRKD4 gene in 35S::GAL4::AtRKD4::GR construction into 16 days after sowing (das) orchid protocorms. The genetic transformation was followed by a glucocorticoid-inducible system with Dexamethasone (DEX) at gradual concentrations 10, 20 or 40 micromolar (uM) for 1 or 2 weeks. Confirmation of the successful insertion and integration of AtRKD genes into the candidate transformants plant genome was conducted by direct PCR using AtRKD4 specific primers. The results showed that 10 mg/l of TDZ in combination with 1 mg/l of NAA was able to induce the formation of somatic embryo directly from P. "Sogo Vivien" in vitro leaf explants. The efficiency of somatic embryo formation is 5,7%, with 57 somatic embryos were formed from one leaf explant. Induction of somatic embryogenesis through genetic transformation using the AtRKD4 gene in 35S::GAL4::AtRKD4::GR construction generated 47 shoots from 14 transformant protocorm candidates. Transformant protocorm candidates were obtained mostly on 10 uM DEX induction treatment for 1 week (80%), while somatic embryos and shoots number were obtained mostly in 40 uM DEX induction treatment for 2 weeks (13 shoots). Confirmation of the successful insertion of AtRKD genes into the candidate of transformant plant genome that conducted by PCR showed all of the transformant protocorms positively contain 268 bp AtRKD4 DNA fragment. The efficiency of AtRKD4 transformation on P. "Sogo Vivien" orchid was 0.04%. Taken together, all data showed that somatic embryogenesis can be induced from leaf explants and protocorms of P. "Sogo Vivien" by using both TDZ and AtRKD4 gene insertion using Agrobacterium mediated transformation.

Kata Kunci : anggrek, embriogenesis somatik, zat pengatur tumbuh, transformasi genetik, AtRKD4 / orchid, somatic embryogenesis, plant growth regulator, genetic transformation, AtRKD4