Kloning dan Ekspresi Gen Penyandi Ag85A Mycobacterium tuberculosis

FIRDAYANTI, Prof. Dr. drh. Wayan Tunas Artama; Prof. Dr. Ni Made Mertaniasih, dr., MS., Sp.MK(K)

2015 | Tesis | S2 Ilmu Kedokteran Tropis

Antigen 85A (Ag85A) M. tuberculosis disandi oleh gen fibronectin binding protein-A (fbp-A) dengan ukuran 1017 nukleotida. Gen fbp-A menyandi protein dengan berat molekul 32 kDa yang merupakan salah satu protein yang disekresikan oleh Mycobacterium tuberculosis dan Mycobacterium bovis. Protein Ag85A berperan menginduksi proliferasi sel T yang kuat dan memproduksi IFN-gamma pada sebagian besar orang sehat yang terinfeksi Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae dan tikus yang divaksinasi BCG, namun demikian tidak ditemukan pada pasien Tuberkulosis atau kusta lepromatosa. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan amplifikasi, kloning dan ekspresi gen penyandi Ag85A M. tuberculosis pada E. coli. Penelitian diawali dengan amplifikasi gen penyandi Ag85A M. tuberculosis dengan metode PCR menggunakan primer spesifik Ag85A M. tuberculosis yang dirancang dari genom M. tuberculosis strain H37Rv. Tahap kloning dimulai dari ligasi produk PCR ke dalam vektor pET SUMO dan ditransformasi ke dalam sel inang E. coli BL21. Pada klon bakteri yang diperoleh dilakukan identifikasi dengan metode PCR untuk mengetahui klon yang membawa gen insert. Ekspresi protein rekombinan Ag85A dilakukan dengan kultur bakteri induksi IPTG 1 mM dan protein dianalisis dengan SDSPAGE. Hasil penelitian menunjukkan produk PCR hasil amplifikasi gen penyandi Ag85A M. tuberculosis menggunakan primer spesifik Ag85A M. tuberculosis diperoleh band spesifik dengan ukuran nukleotida 1017 bp, dan hasil kloning gen penyandi Ag85A M. tuberculosis ditunjukkan dengan adanya pertumbuhan koloni bakteri pada media Luria Bertani (LB) agar dengan kanamisin 50 μg/ml. Hasil transformasi diperoleh empat koloni bakteri yang ditumbuhkan pada media Luria Bertani (LB) padat. Hasil uji tapis dengan metode PCR dari empat koloni bakteri E. coli ditemukan dua koloni yang positif membawa gen Ag85A sebesar 1017 bp. Hasil ekspresi protein rekombinan dengan SDS-PAGE didapatkan pita protein rekombinan Ag85A fusion SUMO dengan berat molekul 52 kDa. Gen penyandi Ag85A M. tuberculosis berhasil dikloning ke dalam vektor pET SUMO dalam sel inang E. coli BL21 dan ekpresi protein rekombinan Ag85A fusion SUMO diperoleh protein dengan berat molekul 52 kDa. Kata kunci: Mycobacterium tuberculosis, Ag85A, kloning, PCR, pET SUMO

ABSTRACT Antigen 85A (Ag85A) Mycobacterium, encoded by genes fibronectin binding protein A (fbp-A) with a size of 1017 bp nucleotides. Fbp-A gene coding for a protein with a molecular weight of 32 kDa which is one of the proteins secreted by Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis. Protein roles Ag85A induce T cell proliferation and IFN-gamma production in most healthy people who are infected with Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae and BCG vaccinated mice, however, is not found in patients with tuberculosis or leprosy lepromatous. This study aims to amplification, cloning and expression of genes encoding Ag85A M. tuberculosis in E. coli. The study begins with amplification of the gene encoding Ag85A M. tuberculosis by PCR using specific primers designed Ag85A M. tuberculosis from M. tuberculosis strain H37Rv genome. Cloning was started with ligation of PCR products into vector pET SUMO and transformed into E. coli BL21 host cells. The bacteria clones were obtained by PCR to determine the clones which carry the gene insert. Expression of recombinant proteins Ag85A was done by bacterial culture, and inducted by 1 mM IPTG and analyzed by SDS-PAGE. The results were showed the PCR product amplification product Ag85A M. tuberculosis gene using specific primers Ag85A M. tuberculosis-specific band obtained with the size of 1017 bp nucleotides, and the cloned gene encoding M. tuberculosis Ag85A indicated by the growth of bacterial colonies on media Luria Bertani (LB) in order to kanamycin 50 mg/ml. Transformation results were obtained four colonies grown on media Luria Bertani (LB) solid. The results of screening was identified by PCR of four colonies of E. coli bacteria was found two positive colonies carrying the gene Ag85A of 1017 bp. Results of recombinant protein expression by SDS PAGE obtained recombinant protein bands Ag85A SUMO fusion with a molecular weight of 52 kDa. Ag85A M. tuberculosis gene was successfully cloned into the vector pET SUMO in E. coli BL21 host cells and recombinant protein expression obtained Ag85A SUMO fusion protein with a molecular weight of 52 kDa. Keywords: Mycobacterium tuberculosis, Ag85A, cloning, PCR, pET SUMO

Kata Kunci : Mycobacterium tuberculosis, Ag85A, cloning, PCR, pET SUMO