Kloning dan Ekspresi Gen Penyandi Antigen 85B (Ag85B) Mycobacterium tuberculosis

SRI APRILIANTI IDRIS, Prof. Dr. drh. Wayan Tunas Artama; Dra. Dr. Ning Rintiswati, M. Kes

2015 | Tesis | S2 Ilmu Kedokteran Tropis

Latar belakang: Mycobacterium tuberculosis memiliki enzim transferase mycolyl yang dikenal sebagai kompleks antigen 85 (Ag85A, Ag85B, Ag85C). Kompleks Antigen 85 (Ag85) adalah anggota fibronektin yang mengikat protein dan dianggap sebagai faktor virulensi yang potensial. Kompleks Ag85 diketahui dapat menginduksi respon imun dan menstimulasi produksi IFN gamma yang diujikan pada hewan coba. Tujuan penelitian: Penelitian ini bertujuan untuk mengamplifikasi, mengkloning dan mengekspresi gen penyandi Ag85B pada E. coli BL21. Metode penelitian: Penelitian dimulai dengan mengamplifikasi gen fbpB (gen penyandi protein Ag85B) dengan menggunakan metode PCR, kemudian hasil PCR diligasi ke vektor plasmid pET SUMO serta ditransformasi ke E. coli BL21. Hasil transformasi E. coli BL21 dilanjutkan dengan produksi protein rekombinan Ag85B. Hasil penelitian: Hasil amplifikasi gen penyandi Ag85B dengan menggunakan metode PCR didapatkan pita/band spesifik AG85B dengan ukuran 978 bp, kemudian hasil PCR berhasil diligasi ke vektor plasmid pET SUMO serta ditransformasi ke E. coli BL21. Hasil transformasi ditumbuhkan ke media Luria Bertani (LB) agar yang mengandung kanamycin dan memperlihatkan adanya koloni bakteri yang tumbuh pada media LB agar dan adanya pertumbuhan bakteri pada rekultur LB cair. Uji gen insert menggunakan metode PCR yang menunjukkan hasil positif dengan adanya pita dengan panjang 978 bp. Hasil kloning dilanjutkan dengan produksi protein rekombinan Ag85 B dengan induksi IPTG. Hasil isolasi pada supernatan dan pelet dianalisis dengan menggunakan SDS-PAGE, hasil SDS-PAGE menunjukkan adanya band/pita pada pelet dengan berat molekul 50 kDa yang merupakan berat molekul dari protein rekombinan Ag85B yang terfusi dengan SUMO. Kesimpulan: Gen penyandi protein Ag85B telah berhasil diamplifikasi dengan ukuran 978bp menggunakan primer yang spesifik terhadap gen tersebut dan di klon ke dalam vektor pET SUMO. Plasmid rekombinan berhasil ditransformasikan pada sel inang E. coli BL21 dan mengekspresikan protein rekombinan dengan berat molekul 50 kDa.

Background: Mycobacterium tuberculosis has mycolyl transferase enzyme known as antigen complex 85 (Ag85A, Ag85B, Ag85C). Antigen complex 85 (Ag85) is a member of fibronectin binding protein and is considered a potential virulence factor. Antigen 85 complex can induce immune response and stimulate production of IFN gamma were tested in experimental animals. Objective: This study aimed to amplify, clone and express genes encoding Ag85B in E. coli BL21. Methods: gene encoding for fbpB (Ag85B protein encoding genes) were amplified by using the PCR, then PCR products were ligated to the vector pET SUMO and transformed into E. coli BL21. Results of the transformation of E. coli BL21 continued with the production of recombinant proteins Ag85B. Result: The result Ag85B gene amplification using PCR method obtained the band specific AG85B to the size of 978 bp, then the results of PCR successfully ligated into the plasmid vector pET SUMO and transformed into E. coli BL21. Results were grown to the media transformation Luria Bertani (LB) containing kanamycin and showed bacterial colonies growing on LB medium and the growth of bacteria in rekultur liquid LB. Insert genes test using the PCR method showed positive results in the presence of a long band with 978 bp. Cloned followed by the production of recombinant proteins Ag85B with IPTG induction. Isolated in the supernatant and pellet were analyzed by using SDS-PAGE, SDS-PAGE results showed a band on pellets with a molecular weight of 50 kDa which is the molecular weight of the recombinant protein fused Ag85B with SUMO. Conclusion: The results that Ag85B protein encoding genes were successfully amplified and cloned into pET SUMO. Recombinant plasmid successfully transformed in E. coli BL21 host cells and express recombinant proteins with a molecular weight of 50 kDa.

Kata Kunci : Mycobacterium tuberculosis, Ag85B, kloning/ Mycobacterium tuberculosis, Ag85B, cloning