MUTASI GEN RET (REarranged during Transfection) DAN EDNRB (ENDOTHELIN B RECEPTOR) PADA ANAK INDONESIA DENGAN PENYAKIT HIRSCHSPRUNG

TITIS WIDOWATI, Prof.dr Yati Soenarto, PhD. SpAK; dr Yudha Patria, PhD. SpAK; dr. Ahmad Hamim Sadewa, PhD

2015 | Disertasi | S3 Ilmu Kedokteran

Penyakit Hirschsprung (HSCR) adalah kelainan malformasi kongenital yang ditandai dengan tidak terbentuknya ganglion saraf enterik pada lapisan submukosa (pleksus Meissneri) dan lapisan myenterik (pleksus Auerbachi) di bagian distal kolon. Hingga saat ini HSCR merupakan salah satu penyebab utama konstipasi kronis pada anak. Penyakit HSCR adalah penyakit yang diwariskan dan sering kali disebabkan oleh mutasi germline pada gen RET dan EDNRB. Laporan penelitian-penelitian sebelumnya tentang mutasi gen RET dan EDNRB sebagai penyebab penyakit HSCR menunjukkan adanya perbedaan antar etnis. Hingga saat ini di Indonesia belum pernah dilakukan penelitian mengenai hal ini. Penelitian ini bertujuan mencari tipe mutasi gen RET dan EDNRB, mengetahui frekuensi mutasi gen RET dan EDNRB serta pengaruh mutasi gen RET dan EDNRB terhadap protein reseptor yang dikode. Lima puluh sembilan pasien anak penderita penyakit Hirschsprung yang dirawat di RSUP Dr. Sardjito antara bulan Maret 2012 – Juni 2013 dan memenuhi kriteria inklusi eksklusi dilakukan skrining untuk mengetahui mutasi pada area koding gen RET dan EDNRB menggunakan polymerase chain reaction (PCR) amplification dan direct sequencing. Mutasi yang ditemukan dilakukan kontrol pada 124 kromosom. Frekuensi dan perbedaan densitas fosforilasi dilaporkan dengan interval kepercayaan 95%. Hasil densitas Western blot dan Densitometri ditampilkan sebagai mean ± SD, perbedaan densitas fosforilasi dianalisis menggunakan unpaired student’s T-test, dengan nilai kemaknaan p < 0,05. Penelitian ini menemukan 9 mutasi missense pada gen RET (7 heterozigot, 2 homozigot) yang dialami oleh 8 pasien dan 1 mutasi missense (heterozigot) pada gen EDNRB. Empat mutasi missense, yaitu R144H ( c431G>A), A756V (c2267C>T), R79W (c235C>T), P270L (c809C>T, dan 1 mutasi splice site (IVS 1880-4A>G) belum pernah dilaporkan sebelumnya (novel), begitu juga mutasi P48L (c143C>T) pada gen EDNRB. Frekuensi mutasi gen RET 15,25 (IK 95% 7,70-26,15)% pada penelitian ini serupa dengan penelitian yang pernah dilaporkan sebelumnya, sedang frekuensi mutasi gen EDNRB 1,69 (IK 95% 0,08-8,08)% menunjukkan hasil yang lebih rendah dibanding laporan penelitian sebelumnya. Empat mutasi dari 9 mutasi yang teridentifikasi terjadi secara de novo, sedang 5 mutasi sisanya diwariskan dari orang tuanya yang sehat. Satu pasien mengalami 2 mutasi, masing-masing mutasi diwariskan dari masing-masing orang tuanya yang sehat. Studi fungsional menunjukkan bahwa 3 dari 8 mutasi missense RET (P270L, A756V, Y1062C) yang teridentifikasi secara signifikan menyebabkan ekspresi fosforilasi-RET yang rendah dibanding RET wild type. Mutasi splice site (IVS 1880-4A>G) terbukti tidak mengganggu proses splicing sehingga bukan merupakan mutasi patogenik. Penelitian ini juga mengidentifikasi polimorfisme A45A, T295T, A432A, G691S, L769L, S904S dan R982C yang pernah dilaporkan sebelumnya dan 2 polimorfisme novel yaitu L940L (ekson 17) dan IVS2608-24G>A (ekson 15). Simpulan, frekuensi mutasi gen RET pada anak Indonesia dengan penyakit HSCR tidak berbeda dengan laporan penelitian sebelumnya, sedang frekuensi mutasi gen xxiv EDNRB lebih rendah dibanding laporan penelitian sebelumnya. Empat mutasi missense gen RET yaitu R144H ( c431G>A), A756V (c2267C>T), R79W (c235C>T), P270L (c809C>T, dan 1 mutasi splice site (IVS 1880-4A>G) adalah novel. Satu-satunya mutasi yang ditemukan pada gen EDNRB yaitu P48L (c143C>T) adalah novel. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa tidak semua mutasi yang teridentifikasi pada gen RET dan EDNRB mempengaruhi fungsi ekspresi protein reseptor yang dikode sehingga bisa disebut sebagai mutasi yang patogenik (disease causing mutation).

Hirschsprung’s (HSCR) disease is a congenital malformation characterized by the absence of the enteric ganglia cells of the submucosal (Meissner) and the myenteric (Auerbacht) plexuses in variable portions of the lower gastrointestinal tract. HSCR is known to be one of the major causes of chronic constipation in children. HSCR is an inherited disease. Germline mutations of RET and EDNRB genes are frequently observed. The associations between the mutations and the occurrence of HSRC varied between various ethnic groups. So far there has been no reports from the Indonesian population. The aims of this study were to assess sequence variants in RET and EDNRB genes in Indonesian children with HSCR; to determine the frequency of those variants and to find out the impact of those mutations to RET and EDNRB proteins. Fifty-nine unrelated HSCR patients hospitalized in Sardjito Hospital between March 2012 to June 2013 were screened for mutation in the coding region of RET and EDNRB genes using polymerase chain reaction (PCR) amplification and direct sequencing. The frequency of mutations were then compared to those of 124 healthycontrol chromosomes. Data were reported as frequency and density of phosphorylation (95%CI). Result of Densitometry and Western blot are presented as mean ± SD. Differences of density were tested using an unpaired student’s T-test, with regarded as statistically significant when p<0,05. We observed 9 (7 heterozygous, 2 homozygous) rare variants coding sequences (RV-CDS) of RET gene in 8 of 59 patients and 1 heterozygous RV-CDS of EDNRB gene in 1 patients. We also observed 4 missense variants R144H (c431G>A), A756V (c2267C>T), R79W (c235C>T), P270L (c809C>T, and 1 possible splice site variant (IVS 1880-4A>G) that have never been reported before (novel), as well as P48L (c143C>T) of EDNRB mutation. The frequency of RET mutation 15,25 (95% CI 7,70-26,15)%, was comparable to previous studies, while frequency of EDNRB mutation, 1,69 (95% CI 0,08-8,08)%, was lower than results in previous study. Four out of 9 mutations arose de novo, while the remaining variants were all inherited from unaffected parents. One patient harbor two RET coding variants, one coming from each unaffected parent. Functional studies showed that 3 out of 8 coding RET missense variants (P270L. A756V, Y1062C) resulted in significantly lower expression of the phosphorylated-RET protein when compared to wild type RET. The possible splice-site variant (IVS 1880-4A>G) did not disturb the splicing process and, therefore, was not considered pathogenic. We identified saveral known polimorphisms for RET (A45A, T295T, A432A, G691S, L769L, S904S, R982C) and 2 novel polimorfisme those are L940L (exon 17) and IVS2608-24G>A (exon 15). In conclusion, the frequency of RET gene mutation in Indonesian children with HSCR disease is comparable to previous studies, while EDNRB mutation is lower than previous studies. Four missense mutations of RET gene R144H (c431G>A), A756V (c2267C>T), R79W (c235C>T), P270L (c809C>T, and 1 splice site mutation xxvi (IVS 1880-4A>G) are novel. The only missense mutation identified in EDNRB gene P48L (c143C>T) is never been reported as well. Our data suggest that not all mutation identified in the RET and EDNRB genes resulted in significantly lower expression of the encode receptor protein to be called pathogenic (disease causing mutation).

Kata Kunci : Penyakit Hirschsprung (HSCR), mutasi gen RET-EDNRB, novel, de novo, Indonesia