PERBAIKAN STRAIN KHAMIR Pichia manshurica dan Rhodosporidium paludigenum MELALUI TEKNIK FUSI PROTOPLAS UNTUK MENINGKATKAN AKTIVITAS INULINASE BERBAHAN DASAR UMBI DAHLIA (Dahlia sp.)

DRS. WIJANARKA,MSI, Prof. Dr. Endang Sutariningsih Soetarto, MSc

2014 | Disertasi | S3 Biologi

Khamir indigenous Pichia manshurica dan Rhodosporidium paludigenum mampu menghasilkan inulinase dengan aktivitas rendah. Salah satu alternatif untuk peningkatan aktivitas inulinase adalah dengan cara memanipulasi genetik melalui fusi protoplas dan optimasi lingkungan. Teknik fusi protoplas merupakan salah satu cara untuk perbaikan strain, secara intraspecifik, interspecifik ataupun intergenerik yang melibatkan dua atau lebih genom induk (parental). Fusi protoplas dapat dilakukan melalui beberapa tahapan kerja yaitu: isolasi protoplas, fusi protoplas, regenerasi protoplas dan analisis hibrid (fusan) hasil fusi. Umbi dahlia (Dahlia sp.) digunakan sebagai sumber inulin untuk digunakan sebagai bahan pembentuk inulinase (E.C. 3.2.1.7.). Tujuan penelitian ini adalah 1) untuk memanfaatkan umbi dahlia sebagai sumber inulin; 2) untuk mendapatkan medium modifikasi dan menguji pertumbuhan P. manshurica dan Rh. paludigenum; 3) untuk mendapatkan strain baru (fusan) penghasil inulinase tinggi melalui fusi protoplas pada kondisi yang tepat; 4) menyeleksi fusan dan 5) menguji faktor lingkungan yang mempengaruhi produksi inulinase dari fusan terpilih. Uji kemampuan tumbuh khamir P. manshuricadan Rh. paludigenum dilakukan pada beberapa media modifikasi yaitu medium inulin cair (M1), taoge inulin cair (M2), potato inulin cair (M3), yeast pepton inulin cair (M4) dan media tepung umbi dahlia (M5). Medium tersebut mengandung inulin sebagai sumber karbon. Isolasi protoplas khamir dilakukan dengan mengkulturkan khamir ke dalam medium khusus yaitu media Malt cair (MIP 1 ), Taoge cair (MIP2 ); Media Erthan (MIP3) dan Yeast Pepton Dextrosa (MIP 4 ). Litik enzim Glucanex 2 mg/ml (L2) dan 4 mg/ml (L4) digunakan untuk isolasi protoplas dan L0 sebagai kontrol. Protoplas yang viabel diamati dengan pewarnaan FDA. Proses fusi protoplas dilakukan dengan mencampur kedua pelet protoplas parental dalam larutan larutan penstabil osmotik sorbitol 1.0 mol/L yang mengandung 30% dan 35% PEG 6000 (Polyethylene glycol). Pelet diiresuspensi dan di tumbuhkan secara taburan pada media PDA dan di inkubasi pada suhu kamar, koloni yang tumbuh adalah fusan. Selanjutnya dilakukan uji analisis hibrid (fusan) meliputi pertumbuhan pada media selektif, uji konsentrasi penghambatan minimum (MIC antifungi), uji biokimiawi, uji kecepatan pertumbuhan (µ), waktu generasi (g) dan uji pewarnaan 4,6-diamino-2 phenil indol (DAPI) serta analisis kuantitatif DNA fusan dibandingkan dengan parental. Pengaruh produksi inulinase meliputi perbedaan konsentrasi tepung umbi dahlia 2.5% = C1; 3.0% = C2 dan 3.5% = C3); waktu inkubasi (T1 = 6 jam ; T2 = 12 jam), konsentrasi sumber nitrogen (NH 4 Cl 0.1% = N1; 0,15% = N2 dan 0.2% = N3) dan pH medium ( pH 6 = P0 dan pH 5 = P1) terhadap fusan terpilih. Hasil penelitian ini menunjukan bahwa medium M5 merupakan jenis medium terbaik untuk pertumbuhan P. manshuricadan Rh. paludigenum, sedangkan untuk isolasi protoplas adalah medium MIP 4 . Pada isolasi protoplas, Perlakuan L4 mempunyai hasil yang lebih baik dari pada perlakuan L2 atau L0 (kontrol). Untuk perlakuan L4 jumlah protoplas yang dihasilkan sebesar 7.2 x 10 10 untuk P. manshurica dan 8.8 x 10 10 untuk Rh. paludigenum, sedangkan L2 (5.2 x 10 10 untuk P. manshuricadan 8.2 x 10 10 Rh. paludigenum) dan L0 (4.4 x 10 10 dan 3.9 x 10 10 ), Hasil pewarnaan FDA Perlakuan L4Pm menghasilkan persentase protoplas tertinggi sebesar 43.65% dan untuk perlakuan L4Rhp sebesar 21,1%. Pada proses fusi protoplas konsentrasi PEG 30% lebih baik dari pada konsentrasi 35%. Berdasarkan seleksi fusan pada media selektif di temukan 8 fusan dan setelah dilanjutkan uji identifikasi didapatkan 1 fusan yaitu fusan F4. Berdasarkan analisis kuantitatif DNA Fusan F4 memiliki konsentrasi 872.75 µg/mL. Nilai ini lebih rendah dibanding P. manshurica yaitu 1539 µg/mL tetapi lebih tinggi di banding Rh. paludigenum yaitu 583.5 µg/mL. Hasil analisis sidik ragam (ANOVA) dan uji BNT menunjukkan bahwa perlakuan N1P1 berpengaruh sangat nyata terhadap aktivitas inulinase dengan aktivitas inulinase yang dihasilkan sebesar 1.07 IU dan merupakan perlakuan yang terbaik. Demikian juga untuk pengaruh C dan T yaitu perlakuan C3T2 mampu menghasilkan aktivitas inulinase sebesar 1.11 IU. Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan, telah ditemukan fusan baru yaitu Fusan F4 yang merupakan fusi antara P. manshuricadan Rh. paludigenum. Fusan F4 memiliki aktivitas inulinase (1.11 IU) dengan konsentrasi NH4 Cl 0.1%, pH 5.0, konsentrasi tepung umbi dahlia 3.5%, waktu inkubasi 12 jam, kecepatan pertumbuhan specifik (µ) sebesar 0.39/jam dan waktu generasi (g) 1.74 jam.

Indigenous yeasts of Pichia manshurica and Rhodosporidium paludigenum were able to produce inulinase enzyme, but the activity relatively low. The aims of the current researches were to improve strain quality inulinase production through enviromenthal conditions and genetics manipulations. One of the techniques used to improvement yeast strain was protoplast fusion technique. Protoplast fusion process could be done through using intraspecific, interspecific and intergeneric involving two or more parental genomes. Protoplast fusion can be performed through several stages namely: isolation of protoplast, protoplast fusion, regeneration of fusion protoplast and analysis of hybrids (fusants). Dahlia (Dahliasp.) tubers were used as an inulin source in the research. The inulin stimulated yeast to produce inulinase enzyme (EC. 3.2.1.7). The purpose of this research was 1) to utilize dahlia tubers as a source of inulin; 2) to get suitable medium for growth of P. manshurica and Rh. paludigenum; ; 3) to get a new strain (fusant) which able to produce higher activity of inulinase through protoplast fusion in proper condition; 4) fusant select and 5) test the environmental factors that influence the production of inulinase from the selected fusant. This study began by examining the ability of both P. manshurica and Rh. paludigenum to grow on some modified media namely: liquid inulin medium (M1), liquid inulin sprouts (M2), liquid inulin potato (M3), liquid yeast peptone inulin (M4) and media dahlia tubers fluor (M5). The media contained inulin as a carbon source. Isolation of yeast protoplasts was done by culturing yeast into a particular media such as liquid medium Malt (MIP1), liquid Sprouts (MIP2); Erthan Media (MIP3) or Yeast Peptone Dextrose (MIP4). Protoplasts were harvested and treated by Glucanex of 0 mg/mL (L0), 2 mg/mL (L2) or 4 mg/mL (L4) and without enzyme Glucanex (L0, control). Fusion process was performed by mixing the two parental pellet in solution osmotic stabilizer sorbitol solution of 1.0 mol / L containing 30% or 35% PEG 6000 (Polyethylene glycol). Resuspension of pellets were carried out and then pellet were poured on PDA and incubated at room temperature. Colonies grew on that media were suspected as fusant. Further analysis of the fusant included growth on selective media, test minimum inhibitory concentration (MIC antifungal), biochemical tests, test growth rate (μ), generation time (g) and 4,6-diamino staining test-2 phenil indole (DAPI), and quantitative analysis of fusant. DNA compared to DNA of parentals. The optimization of inulinase production includes the effect of different concentrations of carbon sources (dahlia tuber flour 2.5% = C1; 3.0% = C2 and 3.5% = C3 ); incubation time ( T1 = 6 hours ; T2 = 12 hours ) , the concentration of nitrogen source ( N1 = 0.1 % NH4Cl , 0.15 % and 0.2 % = N2 = N3 ) and the pH of the medium ( pH 6 and pH 5 = P0 = P1 ) against selec fusant. The results indicated that the M5 medium was the best medium for optimum growth of P. manshuricaand Rh . paludigenum , whereas the best for the isolation of protoplasts was MIP4 medium. The lytic enzyme Glucanex 4 mg/ml ( L4 ) gave better results compared to the 2 mg/ml ( L2 ) or L0 ( control ). By adding Glucanex the number of protoplast obtained were at 7.2 × 10 10 for P. manshurica and 8.8 × 10 10 for Rh . paludigenum, of the L2 ( 5.2 x 10 10 for P. manshuricaand 8.2 x 10 10 for Rh. paludigenum) and L0 ( 4.4 x 10 10 and 3.9 x 10 10 ), FDA staining results showed that the percentage of viable protoplasts were obtained from each of the different treatments. L4Pm treatment resulted in the highest percentage of viable protoplasts which as 43.65 % and for the treatment L4Rhp was 21.1 %. In the process of protoplast fusion, PEG 6000 with a concentration of 30% gave better result than PEG 6000 of 35%. Selection of fusant was based on the selective media in which 8 fusants were found, and continued identification test found 1 fusant, F4. Based on quantitative analysis of DNA electrophoresis fusant F4 ( 872.75 μg/mL ) shows smaller size compared to P. manshurica (1539 μg/mL ) but greater size than Rh . paludigenum( 583.5 μg/mL ). Results of analysis of variance ( ANOVA ) and LSD test, sources of N and P optimization by fusant F4 on inulinase activity showed that the treatment N1P1 very significantly affected on inulinase activity (1.07 IU) and was the best treatment among other treatments. Effect of carbon source and incubation time showed that the interaction C3T2 produce inulinase activity of 1.11 IU and was the best treatment among other treatments. Based on the results of this study, it was concluded that a new fusant namely the fusant F4, obtained from P. manshurica dan Rh. paludigenum. This new fusant (fusant F4) has inulinase activity of 1.11 IU when it was grown on media containing NH4 Cl of 0.1% and pH 5.0 strach of dahlia tuber with incubation time 12 hours, the specific growth rate (μ) of this fusant was 0.39/ hour and generation time of 1.74 hour.

Kata Kunci : Inulinase, fusi protoplas, Pichia manshuricadan Rhodosporidium paludigenum