ISOLASI DAN KLONING GEN PENGKODE ENZIM MERKURI REDUKTASE (merA) PADA ISOLAT Streptomycetes

Wahyu Aristyaning Putri, Dr. Yekti Asih., M.Si

2014 | Tesis | S2 Biologi

merA adalah gen yang mengkode enzim merkuri reduktase, yaitu enzim yang berperan dalam reduksi Hg2+ menjadi Hg0 yang bersifat tidak toksik. Gen ini terdapat pada sistem operon yang disebut mer operon yang terdapat pada DNA kromosomal dan plasmid. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya gen merA pada 4 isolat Streptomycetes yang resisten merkuri dan transformasi gen merA ke dalam vektor kloning dan vektor ekspresi. Penelitian ini dilakukan dengan menguji kemampuan resistensi terhadap merkuri dengan metode Paper disk. DNA kromosomal dan Linear plasmid diisolasi dari Streptomycetes dengan metode lisis alkali dan digunakan sebagai cetakan untuk mengamplifikasi gen merA. Amplifikasi gen merA dilakukan dengan Polimerase Chain Reaction menggunakan primer yang dikonstruksi berdasarkan sequence gen merA pada berbagai Streptomycetes. Gen merA yang didapatkan kemudian dikloning ke dalam vektor kloning Blunt-TOPO dan pMD20 serta vektor pET-28c dan pGEX- 5x-1. Transformasi dilakukan menggunakan sel kompeten E. coli DH5α. Pengujian transforman dilakukan dengan pemotongan plasmid menggunakan enzim restriksi dan sequensing. Hasil penelitian menunjukkan isolat yang masih memiliki kemampuan mereduksi merkuri adalah AS1, AS2 dan BR28 dengan membentuk zona jernih kurang dari 10 mm dengan penambahan 1mM HgCL2 sebanyak 2 μl. Karena isolasi DNA plasmid menggunakan metode lisis alkali tidak berhasil dilakukan, maka dilakukan isolasi DNA kromosomal menggunakan metode Spooling with a Glass Rod. DNA yang didapatkan digunakan sebagai template untuk mengamplifikasi gen merA. Pada penelitian ini didapatkan gen merA dengan panjang 1456 bp pada AS1 dan AS2. Gen merA pada Br28 belum berhasil diisolasi. Kloning gen merA dari AS1 dan AS2 pada pET-28c berhasil dilakukan dengan ORF yang tepat. Gen merA pada AS2 telah berhasil diekspresikan menggunakan vektor pGEX-5x-1. Dari penelitian ini diketahui bahwa gen merA pada AS2 mirip dengan gen merA pada Streptomyces lividans TK24 dan AS1 mirip dengan Streptomyces sp. Plasmid CHR28.

merA is a gene that encodes mercuric reductase enzyme, an enzyme that plays a role in the reduction of Hg2+ into Hg0 that is less toxic. The gene is a part of operon system called the mer operon which contained on chromosomal and plasmid DNA. This study aims to isolate merA gene and clone this gene into cloning and expression vector. This research was carried out by testing the ability of resistance to mercury with Paper disk method. Linear plasmid and chromosomal DNA was isolated from Streptomycetes used alkaline lysis method. merA gene obtained then cloned into Blunt-TOPO and pMD20 vector. Transformation was done using competent cells of E. coli DH5α. The results showed that isolate AS1, AS2 and BR28 still have the ability to reduce mercury. They form clear zones less than 10 mm with the addition of 1 mM HgCl2 2 μL. Because plasmid DNA isolation using the alkaline lysis method was not successful, then the isolation of chromosomal DNA using Spooling with a Glass Rod methods was done. Chomosomal DNA was used as a template to amplify the merA gene. In this study, the gene merA obtained on the size of 1456 bp. Cloning and transformation performed on E. coli DH5α. Br28’s merA gene was not isolated yet. Cloning of merA gene from AS1 and AS2 into pET-28c succesfully done with the correct of open reading frame. merA gene of AS2 succesfully expressed using pGEX-5x-1 vector. merA gene sequences of AS2 is closed to merA gene of Streptomyces lividans TK24 and AS1 closed to Streptomyces sp. CHR28 plasmid.

Kata Kunci : merA, vektor, kloning, sequencing