PENGEMBANGAN METODE ANALISIS CEPAT CEMARAN BAKTERI PATOGEN Staphylococcus aureus DALAM SUSU DENGAN REAL TIME POLYMERASE CHAIN REACTION (RTi-PCR)

RISNITA VICKY L, Dr. Tri Joko Raharjo, M.Si.

2014 | Skripsi | KIMIA

Telah dilakukan analisis cemaran bakteri Staphylococcus aureus pada susu dengan Real Time Polymerase Chain Reaction (RTi-PCR) dalam susu dengan target gen nuc S. aureus. Penelitian ini bertujuan mengembangkan metode deteksi cepat terhadap cemaran S.aureus dalam susu. Penelitian yang dilakukan dibagi menjadi tiga tahap yaitu pengembangan metode, validasi metode dan aplikasi metode. Pengembangan metode meliputi isolasi DNA S. aureus, kuantifikasi DNA dengan spektrofotometri UV-Vis dan amplifikasi dengan metode RTi-PCR. Amplifikasi dilakukan dengan menguji temperatur annealing (Ta) antara 58 – 60 °C untuk memperoleh Ta optimal. Kondisi RTi-PCR adalah denaturasi awal 95 °C selama 3 menit, denaturasi 95 °C selama 5 detik, annealing pada Ta optimal selama 30 detik serta Melting Curve Analysis. Validasi metode yang dikembangkan meliputi uji spesifisitas, uji presisi dan penentuan cut off detection. Spesifisitas metode diuji dengan membandingkan analisis pada susu terkontaminasi S.aureus dan susu tidak terkontaminasi. Presisi metode diamati dengan melakukan pengulangan analisis terhadap susu terkontaminasi S. aureus. Penentuan cut off detection dilakukan dengan analisis susu yang dikontaminasi S.aureus dengan variasi konsentrasi bakteri. Aplikasi metode yang dikembangkan dilakukan pada susu yang dijual di pasaran lokal. Hasil penelitian menunjukkan metode RTi-PCR dengan primer nuc A1 dan nuc A2 spesifik mendeteksi DNA bakteri S. aureus dengan Tm (melting temperature) amplikon 79 °C. Ta optimal untuk PCR adalah 58 °C. Metode RTi- PCR spesifik mendeteksi susu yang terkontaminasi S. aureus. Uji repitabilitas menunjukkan susu yang terkontaminasi S. aureus memiliki Tm amplikon 78,5 – 79 °C dan nilai rata-rata Ct (Cycle number threshold) adalah 32,63 ± 1,08. Metode dapat mendeteksi S. aureus hingga 1,04 × 101 CFU/mL sampel. Hasil aplikasi metode menunjukkan dua sampel susu pasteurisasi, susu yang dijual di pasar tradisional dan susu yang dijual di warung susu positif terdeteksi adanya S. aureus dan susu UHT tidak terdeteksi.

Contamination of pathogenic bacteria Staphylococcus aureus in milk samples have been analyzed using Real Time Polymerase Chain Reaction (RTi- PCR) with target of nuc gene. The research aims to develop rapid analysis method S. aureus contamination in milk. The study was divided into three stages which are development, validation and application of the method. Method development comprised isolation of S. aureus DNA, quantification of DNA by spectrophotometry UV-VIS and amplification by RTi-PCR. Amplification was performed by testing annealing temperature (Ta) at 58 – 60 °C for obtaining optimal Ta. RTi-PCR condition are predenaturation at 95°C for 3 minutes, denaturation at 95 °C for 5 seconds, annealing at Ta optimal for 30 seconds with Melting Curve Analysis. Method validation consisted of spesificity test, precision test and cut off detection test. Spesificity of the method was checked using artificially S. aureus contaminated milk with uncontaminated sample. Precision was tested by performing repeated analysis artificially S. aureus contaminated milk. Cut off detection was tested by analyzing contaminated milk with variation of the bacteria concentration. Application method was performed by testing of commercial milk. The result show RTi-PCR method with primer nuc A1 and nuc A2 is spesific for DNA detection of S. aureus with Tm (melting temperature) amplicon 79 °C. Optimal Ta for PCR is 58 °C. The method show high spesificity for detecting artificially S. aureus contaminated milk. Repitability test show artificially S. aureus contaminated milk samples have Tm amplicon 78,5 – 79 °C and average Ct (Cycle number threshold) 32,63 ± 1,08. RTi-PCR method can detect S. aureus up to 1,04 × 101 CFU/mL in the sample. RTi-PCR analysis for commercial milk show two samples of pasteurized milk, one milk sample sold in traditional market and one milk sample sold in a small cafe are contaminated with S. aureus whereas UHT milk sample is not.

Kata Kunci : Staphylococcus aureus, susu, RTi-PCR