ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA BIOAKTIF DARI KULIT BATANG Bruguiera gymnorrhiza Lamk YANG BERSIFAT SITOTOKSIK DENGAN MEKANISME APOPTOSIS PADA SEL KANKER HeLa

WARSINAH, Prof. Dr. Sismindari, SU., Apt.

2013 | Disertasi | S3 Ilmu Farmasi

Kanker merupakan salah satu ancaman utama dibidang kesehatan karena kejadian dan kematian penderita setiap tahun meningkat, kanker servik adalah salah satu jenis. Upaya pengatasan kanker dengan kemoterapi belum memberikan hasil yang memuaskan dan sering dihubungkan dengan efek samping yang merugikan dan timbulnya resistensi sel, sehingga pencarian senyawa baru antikanker dari bahan alam terus digalakkan. Bruguiera gymnorrhiza (mangrove) merupakan tanaman pantai yang khas dan telah dimanfaatkan secara tradisional untuk mengobati penyakit gastroenteritis dan kanker. Tujuan penelitian ini adalah melakukan fraksinasi ekstrak metanol untuk mendapatkan senyawa aktif yang bersifat sitotoksik dan melakukan uji aktivitas antiproliferatif, induksi apotosis dan ekspresi beberapa protein serta identifikasi struktur isolat aktif tersebut. Fraksinasi ekstrak methanol kulit batang B. gymnorrhiza dilakukan dengan cara triturasi berturut-turut secara bertingkat menggunakan pelarut n-heksan, kloroform dan etilasetat. Ketiga fraksi tersebut diuji aktivitas sitotoksiknya terhadap sel HeLa pada konsentrasi 1000, 5000, 250, 125 dan 62,5 μg/ml. Fraksi aktif (fraksi kloroform) dipisahkan lebih lanjut dengan kromatografi kolom cair vakum menggunakan fase diam silika gel 60 H dengan fase gerak campuran pelarut n-heksan, kloroform, etilasetat dan metanol dengan polaritas yang semakin meningkat. Fraksi yang diperoleh digabungkan berdasarkan kromatografi lapis tipis (KLT). Fraksi gabungan diuji aktivitas sitotosiknya. Fraksi aktif yang diperoleh (F2) dipisahkan lagi dan menghasilkan fraksi aktif S3, pemisahan lebih lanjut menghasilkan fraksi aktif T4. Pemisahan T4 menghasilkan fraksi aktif I2 yang selanjutnya dimurnikan dengan kromatografi kolom sephadex LH 20 yang dielusi dengan metanol menghasilkan isolat aktif berwarna ungu. Isolat diuji aktivitas sitotoksik dan antiproliferatif menggunakan metode MTT, induksi apoptosis menggunakan metode double staining dan flowcytometri, serta ekspresi protein p53, Bcl2 dan caspase3 menggunakan metode imunositokimia. Struktur isolat yang diperoleh diidentifikasi menggunakan metode spektroskopi UV-Vis, IR, LC-MS dan NMR. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi kloroform mempunyai efek sitotoksik dengan IC50 sebesar 134 μg/ml. Fraksi aktif F2, S3, T4, I2 dan isolat aktif mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap sel HeLa berturut–turut dengan IC50 69,4; 14,68 ; 9,9 ; 4,72 dan 4,13 μg/ml. Isolat aktif (2 μg/ml) mampu menghambat proliferasi sel sebesar 45,09% (jam 72) dan konsentrasi 4 μg/ml sebesar 56,12% (jam 48). Pada konsentrasi 2 μg/ml isolat aktif mampu menginduksi apoptosis sebesar 43,26 %, kontrol sel 17,90% dan doxorubicin 68,12%. Pemacuan apoptosis ditunjukkan dengan adanya ekspresi protein p53 dan caspase 3 yang lebih tinggi serta ekspresi Bcl-2 yang lebih rendah dibandingkan dengan kontrol sel.Spektrum UV-Vis isolat menunjukkan adanya tiga puncak absorpsi pada panjang gelombang 232 nm, 319 nm dan 513 nm. Spektrum Inframerah isolat menunjukkan adanya gugus OH, C=O keton, C-H alifatis, C=C, C-O, metil dan metilen. Dari hasil analisis LC-MS diketahui bahwa isolat belum murni dan masih mengandung dua senyawa dengan waktu retensi 3.64 menit dan 10.69 menit. Dari spektrum 1H-NMR yang memperlihatkan signal-signal resonansi yang cukup kompleks pada  0,85-2,31 dan 3,3 -4,0 dan spektra NMR lainnya diduga isolat aktif B.gymnorrhiza tersebut mengandung saponin.

Cancer is one of the worldwide health issue since the incident and mortality caused by cancer continues to increase every year, one of those is cervical cancer. Treatment of cancer with chemotherapeutic drugs have not given satisfactory results and is often associated with adverse side effects and caused resistance of cancer cells, therefore searching of new anticancer compounds having new template structure from natural products continue to be carried out. Bruguiera gymnorrhiza (mangrove) is a typical coastal plant and has been used traditionally to cure gastroenteritis disease and cancer. The objectives of this study are to fractionate the methanol extract to obtain active isolate and to investigate the cytotoxic, antiproliferative and apoptosis induction activities, as well as to evaluate the expression of several proteins and to identify the structure of active isolate. Fractionation of the methanol extract of the B. gymnorrhiza stem bark was done by successive trituration using n-hexane, chloroform and ethyl acetate. Fractions were then tested their cytotoxic activities against HeLa cells. The active fraction (Chloroform fraction) was further separated by vacuum liquid chromatography using silica gel 60 H gradiently eluted with different mixture of solvents (n-hexane, chloroform, ethylacetate dan methanol). The fractions obtained were analyzed by thin layer chromatography (TLC). Fractions with similar TLC profiles are combined and tested their cytotoxic activity. Separation of the active fraction F2 gave the active fraction S3 which was further separated to give active fraction T4. Separation of T4 gave active fraction I2, which was further purified by column chromatography on sephadex LH 20 eluted with methanol yielded purple active isolate. The active isolate was tested its cytotoxic and antiproliferative activities using MTT assay, while its apoptosis induction was analyzed using double staining and flowcytometri methods, and the expression of p53, Bcl2 and caspase3 were investigated using immunocytochemistry method. The structure of active isolate was identified using UV-Vis, IR, LC-MS and NMR spectroscopic methods The result showed that chloroform fraction had cytotoxic activity with the IC50 of 134 μg/ml. The active fractions F2, S3, T4, I2, and active isolate had cytotoxic effect against HeLa cell with the IC50 of 69.4 μg/ml; 14.68 μg/ml; 9.9 μg/ml; 4.72 μg/ml; and 4.13 μg/ml respectively. Active isolate could inhibited 45.09% of cell proliferation (72 hours) at concentration of 2 μg/ml and 56.12% (48 hours) at concentration of 4μg/ml. Active isolate could induce apoptotic process 43.26%. It was higher than control cell (17.90%) but than doxorubicin at the same dose (68.12%). Apoptotic induction could also been shown by the higher expression of p53 and caspase 3 proteins and the lower expression of Bcl-2 compared to the control. The UV-Vis spectrum of isolate showed the presence of three absorption peaks at a wavelength of 249 nm, 319 nm and 549 nm. The Infrared spectrum indicated the presence of OH, ketone C = O, aliphatic CH, C = C, C - O, methyl and methylene groups. From the LC-MS analysis, it is known that the isolate was not pure and still contained two compounds with retention time of 3.64 minutes and 10.69 minutes. The 1H-NMR spectrum showed quite complex resonance signals around  3.3-4.0 and 0.85-2.31 and other NMR spectra, it was suspected that the active isolate of B. gymnorrhiza contains saponins.

Kata Kunci : -