APLIKASI MULTIPLEX POLYMERASE CHAIN REACTION (m-PCR) UNTUK DETEKSI Mycobacterium tuberculosis DAN Mycobacterium bovis PADA DOMBA

Yohanes Timbun Raja Mangihut Ronael Simarmata, Prof. Dr. drh. Ida Tjahajati, MP.

2013 | Tesis | S2 Sain Veteriner

Tuberkulosis (TB) merupakan penyakit zoonosis penting yang sampai saat ini merupakan masalah besar baik pada manusia maupun hewan. Diagnosa dini TB merupakan masalah yang sangat penting mengingat penyakit TB dapat ditularkan melalui udara, sehingga diagnosis cepat dan akurat merupakan kunci utama dalam mencegah penyebaran penyakit ini. Adanya kenyataan TB pada ternak di lapangan yang punya resiko sebagai sumber penularan ke manusia, mendorong untuk dikembangkannya metode diagnosis yang cepat dan akurat. Metode m-PCR yang dapat mendeteksi lebih dari satu jenis bakteri sekaligus, membuka peluang pembuatan Kit Diagnosis TB yang sekaligus dapat mendeteksi adanya M.tuberculosis dan M.bovis yang merupakan penyebab tuberkulosis yang berbahaya bagi ternak maupun manusia. Tujuan penelitian adalah aplikasi metode m-PCR untuk deteksi M.tuberculosis dan M.bovis pada domba dengan dengan primer spesifik yang dapat membedakan DNA M.tuberculosis dan M.bovis Sampel yang digunakan adalah organ paru dan limfoglandula domba (Ovis aries) suspect penyakit TB asal Yogyakarta. Isolasi DNA menggunakan PureLinkTM Hasil m-PCR dari sampel organ paru dan limfoglandula domba adalah 4 domba yang terinfeksi M.tuberculosis dan M.Bovis. Dua domba posisi band 168 bp (positif M.bovis), 2 domba berada pada band 297 bp (positif M.tuberculosis). Hasil Sekuen, runutan nukleotida memiliki keidentikan 90%-100% dengan runutan nukleotida Genomic DNA Kits produksi Invitrogen dengan mengikuti prosedur dari pabriknya. Hasil isolasi DNA yang digunakan untuk cetakan pada proses amplikasi dengan metode m-PCR menggunakan primer forward 5’-TTCCGAATCCCTTGTGA-3’ berkode CSB1, primer reverse 5’- GGAGAGCGCCGTTGTA-3’ berkode CSB2 (M.bovis) dan primer reverse 5’-AGTCGCGTGGCTTCTCTTTTA-3’ berkode CSB3 (M.tuberculosis). Hasil positif amplifikasi DNA dan PCR di gel agarose dengan band pada ukuran 297 bp (M. tuberculosis) dan 168 bp (M. bovis). M.bovis BCG str. Korea dan M.tuberculosis H7Rv complete genom di GenBank, hasil ini diperkuat dengan tumbuhnya koloni pada kultur bakteri di media ogawa. Metode m- PCR dengan menggunakan primer spesifik (CSB1, CSB2, CSB3) dapat diaplikasikan untuk deteksi M.tuberculosis dan M.bovis pada domba. Penyakit TB pada domba dapat disebabkan oleh M.tuberculosis selain M.bovis dan M.Caprae.

Tuberculosis (TB) is an important zoonotic disease which until now is a major problem in both humans and animals. Early diagnosis of TB is a very important issue considering TB disease can be transmitted through the air, so that rapid and accurate diagnosis is a key in preventing the spread of this disease. The fact of TB in cattle in the field as a potential source of transmission to humans, encouraging the development of methods for rapid and accurate diagnosis. The m-PCR method which can detect more than one type of bacteria at a time, enabling the construction of TB diagnosis kit which can simultaneously detect the presence of M. tuberculosis and M.bovis which is the cause of tuberculosis that is harmful to animals and humans. The purpose of this research is the application of m-PCR method for detection of M. tuberculosis and M.bovis in sheep with the specific primers that can differentiate the DNA of M. tuberculosis and M. bovis. The samples used were obtained from pulmonary and limfoglandula organs of sheep (ovis aries) with suspect TB from Yogyakarta. Isolation of DNA were conducted using PureLink TM The m-PCR results from samples of lung and limfoglandula of the suspect sheep showed 4 sheep infected by M tuberculosis and M.bovis. Two isolated DNA showed at position of 168 bp (positive M.bovis), and 2 isolates were at 297 bp (positive M. tuberculosis). Sequences analysis results showed a highly similarity (90% -100%) with others nucleotide sequences of Genomic DNA kit Invitrogen production by following the manufacturer's procedure. Isolated DNA then were used as template in the m-PCR amplification process using forward primer 5'-TTCCGAATCCCTTGTGA-3', coded CSB1, reverse primer 5'- GGAGAGCGCCGTTGTA-3', coded CSB2 (M.bovis) and reverse primer 5'- AGTCGCGTGGCTTCTCTTTTA-3', coded CSB3 (M.tuberculosis). The PCR amplification product then were reconfirmed by agarose gel electrophoresis as positive result showed at the band of 297 bp (M.tuberculosis) and 168 bp (M.bovis). M.bovis BCG str. Korea and M. tuberculosis H37Rv complete genomes in GenBank. The result were reinforced by the growth of bacterial colonies on ogawa media. From the whole analysis, this study conclude that the m-PCR method using specific primers (CSB1, CSB2, CSB3) can be applied for detection of M. tuberculosis and M. bovis on sheep. The TB disease in sheep can be caused by M.tuberculosis, besides M.bovis and M.caprae.

Kata Kunci : M. tuberculosis, M. bovis, domba, multiplex Polymerase Chain Reaction (m-PCR)