VALIDASI UJI KONTAMINASI BABI DALAM NUGGET DENGAN METODE REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION (RTi-PCR)

IMELDA O. TAMPUBOLON, Dr. Tri Joko Raharjo, M.Si

2013 | Skripsi | KIMIA

Telah dilakukan validasi uji kontaminasi babi dalam nugget dengan metode real-time Polymerase Chain Reaction (rti-PCR). Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan metode identifikasi DNA babi pada nugget berbasis uji DNA sehingga dapat digunakan sebagai metode uji untuk autentikasi kehalalan pangan. Real-time PCR mengamplifikasi DNA target NADH sub unit ND5 di mitokondria babi menggunakan primer spesies spesifik yaitu primer forward ND5 (5’-CATTCGCCTCACTCACATTAACC-3’), dan primer reverse ND5 (5’-AAGAGAGAGTTCTACGGTCTGTAG-3’). Tahapan penelitian terdiri atas penentuan temperatur annealing (Ta) dan validasi metode meliputi uji spesifisitas, uji presisi dan penentuan batas deteksi. Aplikasi metode real-time PCR digunakan untuk deteksi cemaran babi pada nugget. Isolasi DNA nugget menggunakan metode fenol KIAA. Amplifikasi fragmen DNA dilakukan dengan kondisi PCR pra denaturasi pada temperatur 95 °C selama 30 detik, denaturasi pada temperatur 95 °C selama 2 detik dan penempelan primer pada Ta optimal hasil optimasi metode selama 5 detik. Hasil amplifikasi DNA menggunakan metode real-time PCR dengan primer ND5 menghasilkan amplikon dengan titik lebur sebesar 79 °C dan pita fragmen 227 pasang basa melalui uji kualitatif elektroforesis gel agarose. Temperatur annealing optimal yang diperoleh sebesar 58 °C. Metode tervalidasi memiliki spesifisitas dan sensitivitas yang tinggi, primer ND5 spesifik mengamplifikasi DNA babi dan batas deteksi batas deteksi hingga 1% kontaminasi babi dalam produk pangan. Tujuh sampel yang diujikan terbukti tidak mengandung daging babi.

Porcine contaminant on nugget have been analyzed using real-time Polymerase Chain Reaction (RTi-PCR). The aim of this study is to develop porcine identification method on nugget based DNA which can be used as halal authentication. Real-time PCR amplified ND5 target gene in pork’s mithochondria DNA using species-specific primer, namely forward primer ND5 (5’-CATTCGCCTCACTCACATTAACC-3’), and reverse primer ND5 (5’-AAGAGAGAGTTCTACGGTCTGTAG-3’). The steps of this study consisted of determining the annealing temperature (Ta) and the method validation include the specificity, precision and determination of the limit detection. Real-time PCR application used for detection porcine contamination on nuggets. DNA was isolated using phenol KIAA. Amplification of DNA fragments was conducted with PCR conditions : pre-denaturation 95 °C for 30 s, denaturation 95 °C for 2 seconds and annealing at optimal Ta result for 5 seconds. DNA amplification using real-time PCR with primers ND5 produced an amplicon with a melting point of 79 °C and 227 base pair fragment through agarose gel electrophoresis. The optimal annealing temperature was 58 °C. Validated method had high specificity and sensitivity, specific primers amplified DNA ND5 pigs and the detection limit up to 1% porcine contamination in food products. Seven samples were tested and proved not contain pork.

Kata Kunci : Halal, Nugget, DNA Babi, Primer ND5, real-time PCR