PENGEMBANGAN KIT ELISA UNTUK DETEKSI IMUNOGLOBULIN G DAN M TERHADAP VIRUS INFLUENZA MENGGUNAKAN ANTIGEN VIRUS H5N1 ISOLAT LOKAL

Sidna Artanto, Drh., Ir. Irfan D. Prijambada, M. Eng., Ph.D. ; drh. Heru Susetya, M.P., Ph.D.

2013 | Tesis | S2 Bioteknologi

Avian Influenza (AI) merupakan penyakit infeksius penting pada unggas yang disebabkan oleh virus avian influenza (VAI) tipe A dari kelompok Orthomyxoviridae. Penyebaran highly pathogenic avian influenza (HPAI) subtipe H5N1 di beberapa negara di dunia mengancam populasi hewan dan kesehatan masyarakat. Diagnosis yang efektif dan manajemen kontrol yang tepat sangat dibutuhkan untuk pengendalian penyakit ini. Deteksi AI merupakan salah satu sarana utama dalam pengendalian dan pencegahan AI. Penelitian ini mempunyai tujuan untuk mengembangkan perangkat deteksi immunoglobulin G (IgG) dan IgM spesifik AI menggunakan hewan model mencit (Mus musculus). Uji IgG dan IgM diharapkan dapat memberikan gambaran tanggap kebal yang lebih spesifik. Metodologi yang dipakai berdasarkan teknik Enzyme Immunosorbent Assay (ELISA). Prinsip kerja teknik tersebut adalah antigen AI yang dilapiskan pada solid phase berupa multi-well plates akan berikatan dengan IgG dan IgM khas AI dari serum yang diuji. IgG dan IgM yang berikatan dengan antigen tersebut selanjutnya akan ditangkap oleh conjugate anti-IgG/IgM yang diberi enzim alkaline phosphatase. Pemberian substrat para-Nitrophenylphosphate (p-NPP) yang bersifat kromogenik menjadi indikator sekaligus dapat digunakan untuk mengkuantifikasi komplek antigen dan Ig yang berikatan menggunakan ELISA reader dengan panjang gelombang 415 nm. Hasil penelitian menunjukkan bahwa konsentrasi protein suspensi virus hasil purifikasi menggunakan teknik ultrasentrifugasi pada gradient sukrosa 30% dan 60% adalah 1,068 μg/mL dengan aktivitas hemaglutinasi 24 HA unit. Hasil ELISA checkerboard untuk pengukuran IgM menunjukkan rasio P/N mencapai nilai optimum 1,776 pada konsentrasi antigen 0,791μg/cm2, serum 1/100 dan conjugate 1:1000. Untuk pengukuran IgG rasio P/N mencapai nilai optimum 4,506 pada konsentrasi antigen 0,791μg/cm2, serum 1/200 dan conjugate 1:1000. Perangkat ELISA untuk pengujian IgM dan IgG pada mencit yang diimunisasi vaksin AI inaktif menunjukkan adanya peningkatan IgM yang teramati pada 5 hari setelah imunisasi. IgG yang timbul hingga 35 hari setelah imunisasi pertama lebih lambat dan meningkat secara perlahan. IgM dan IgG yang muncul setelah pemberian vaksin ke-2 (35 hari dari imunisasi pertama) lebih tinggi dibandingkan respon pertama.

Avian Influenza (AI) is an important infectious disease in poultry and caused by avian influenza virus (VAI) type A of the Orthomyxoviridae group. The spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of subtype H5N1 in several countries around the world threatens the population of animals and public health. Effective diagnosis and appropriate control management are needed to control this disease. Detection of AI is one of the main instruments to control and prevent of AI. This research was aimed to develop a device of detecting IgG and IgM against AI using mice (Mus musculus) as an animal model. The methodology used is based on an ELISA technique, immunoglobulin G (IgG) and IgM against AI would bind to viral antigen, which was previously coated on multi-well plates. IgG and IgM binding to the antigen captured by a conjugate anti-IgG/IgM labeled with alkaline phosphatase. Treating with chromogenic para-Nitrophenylphosphate (p-NPP) substrate would be the indicator all at once could be used to quantify the antigen-Ig complex using ELISA reader with a wavelength of 415 nm. The results showed that the concentration of purified protein from virus suspension using techniques of ultracentrifugation on a sucrose gradient of 30% and 60% was 1.068 μg/mL with 24 HA units of hemagglutination activity. The results of ELISA checkerboard for measuring IgM showed the ratio of P/N reaching an optimum value of 1.776 at the optimum concentration of antigen 0,791μg/cm2, serum 1/100 and conjugate of 1:1000. The measurement of IgG ratio P/N achieved optimum value of 4.506 at antigen concentration of 0,791μg/cm2, the serum 1/ 200 and conjugate 1:1000. The applications of ELISA device for detection IgM and IgG responses in mice immunized with inactivated AIV vaccines increased the response of observed IgM on the five-day post vaccination. The IgG responses arising up to 35 days for the primary vaccination increased more slowly and gradually. The IgM and IgG emerging after treating the second vaccine (35 days from the primary vaccination) was stronger than the primary response.

Kata Kunci : ELISA, avian influenza, antigen, IgG, IgM