Kloning Gen, Ekspresi dan Purifikasi Protein ORF25 Koi Herpesvirus Sebagai Kandidat Vaksin

Cahya Kurnia Fusianto, Dr. Ir. Murwantoko, M.Si.

2013 | Tesis | S2 Bioteknologi

Koi Herpesvirus (KHV) merupakan salah satu masalah pada budidaya ikan karper dan koi (Cyprinus carpio). Serangan KHV dapat menyebabkan kematian 100% . Vaksinasi merupakan salah satu metode penanggulangan penyakit virus. Glikoprotein virus telah banyak diketahui bersifat immunogenik dan digunakan sebagai vaksin. Penelitian ini bertujuan mengkloning gen, mengekspresikan dan mempurifikasi protein ORF25 KHV (penyandi glikoprotein membran) sebagai kandidat vaksin. Ikan karper dari Magelang yang terkonfirmasi terinfeksi KHV digunakan dalam penelitian ini. Primer didesain mengamplifikasi ORF25 dengan menghilangkan bagian hidrofobik, ORF25 KHV berhasil diamplifikasi dan dikloning pada vektor pET32a. Hasil analisis sekuen menunjukkan ORF25 KHV isolat Indonesia mempunyai kesamaan dengan Cyprinid herpesvirus 3 DNA strain TUMST1 isolat Jepang; Koi herpesvirus strain KHV-U, isolat Amerika dan KHV-I, isolat Israel sebesar 98%. Prediksi epitop sel T dengan software Genetyx menunjukan ORF25 KHV memiliki 9 epitop pola Iad dan 8 epitop pola Rothbard/Taylor. Prediksi epitop sel B dengan “B Cell Epitope Prediction Tools” dari IEDB menunjukkan ORF25 KHV memiliki 3 epitop berdasarkan Emini surface accessibility scale, 23 epitop berdasarkan Karplus and Schulz flexibility scale, 10 epitop berdasarkan Kolaskar and Tongaonkar antigenicity scale, 4 epitop discontinue dan 4 epitop continue berdasarkan software Elipro. Hasil ini menunjukan ORF25 KHV diprediksi bersifat imunogenik. Protein rekombinan ORF25 KHV telah berhasil diproduksi dalam bakteri E. coli BL21 cd(DE3). Protein tersebut diproduksi dalam bentuk insoluble, dan produksi optimal ketika dilakukan induksi IPTG pada OD 1, dengan konsentrasi 1 dan diinkubasi selama 18 jam. Protein dengan ukuran sekitar 53 kd, berhasil dipurifikasi menggunakan Ni-NTA.

Koi Herpesvirus (KHV) is one of the problems in carp and Koi (Cyprinus carpio) aquaculture. KHV can cause 100% mortality. Vaccination is one prevention method of viral diseases. Virus glycoprotein has been widely used as vaccine. The objectives of this research are to clone genes, express and purify proteins ORF25 KHV (encoding membrane glycoprotein) as a vaccine candidate. confirmed infected KHV of Carp from Magelang was used in this research. Primers were designed to amplify ORF25 by eliminating the hydrophobic clusters. KHV’s ORF25 was successfully amplified and cloned in pET32a expression vector. Sequence analysis showed that Indonesian KHV’s ORF25 isolate has high simmilarity with cyprinid herpesvirus 3 DNA strain Japan, Israel, and America by 98%. T-cell epitope prediction using GENETYX, showed that ORF25 has 9 iAd epitopes pattern and 8 Rothbard / Taylor pattern. B cell epitope prediction using \"B Cell epitope Prediction Tools\" from IEDB showed ORF25 has 3 epitops by Emini surface accessibility scale, 23 epitopes by Karplus and Schulz flexibility scale, 10 epitopes by Kolaskar and Tongaonkar antigenicity scale, 4 discontinue epitopes and 4 linear epitopes based Ellipro software. This result suggests that KHV’s ORF25 is predicted to be immunogenic. KHV ORF25 recombinant protein has been successfully produced. Production was achieved in E. coli BL21 cd (DE3). The protein was produced in insoluble form and optimal when IPTG induction at OD 1, with a concentration of 1mM and incubated for 18 hours. Protein with a size of about 53 kd was successfully purified using Ni-NTA.

Kata Kunci : Koi Herpesvirus, ORF25, kloning, ekspresi, purifikasi, vaksin rekombinan