OPTIMASI METODE PCR DAN ANALISIS FILOGENETIK BERDASARKAN GEN 16S rRNA BAKTERI PENYEBAB PENYAKIT BUSUK LUNAK ANGGREK

RR NANDA KUSUMANDARI, Dr. Tri Joko, S.P., M.Sc.

2013 | Skripsi | ILMU HAMA & PENYAKIT TUMBUHAN

Penyakit busuk lunak merupakan salah satu penyakit penting pada tanaman anggrek yang disebabkan oleh bakteri patogen. Banyak cara yang biasa digunakan untuk mengidentifikasi bakteri patogen tumbuhan salah satunya dengan analisis urutan basa nukleotida gen 16S rRNA. Optimasi untuk mengamplifikasi gen 16S rRNA perlu dilakukan untuk mengefisienkan waktu dan penggunaan bahan sehingga proses identifikasi dapat dilakukan dengan cepat dan tepat. Penelitian ini bertujuan untuk (1) menentukan konsentrasi DNA dengan primer maupun konsentrasi kultur murni bakteri dengan primer yang paling tepat untuk mendapatkan fragmen gen 16S rRNA; (2) mengidentifikasi bakteri penyebab penyakit busuk lunak pada anggrek berdasarkan analisis gen 16S rRNA. Optimasi PCR menggunakan beberapa variasi pengenceran pada DNA, kultur murni bakteri, dan primer untuk mengamplifikasi gen 16S rRNA. Identifikasi bakteri patogen busuk lunak anggrek menggunakan analisis hasil sekuensing pada program BLAST di web NCBI untuk mengetahui kemiripan antara isolat bakteri dengan strain refrensi di bank gen. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa konsentrasi yang paling optimal untuk mengamplifikasi gen 16S rRNA yaitu DNA dan primer sebesar 63,4 ng/μl dan 10 pmol, sedangkan konsentrasi kultur murni dan primer sebesar 8 x 109 CFU/ml dan 10 pmol. Berdasarkan analisis BLAST hasil sekuensing yang dicocokkan di bank gen maka bakteri patogen busuk lunak anggrek tersebut memiliki indeks kemiripan 99-100% dengan beberapa genus bakteri yaitu Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Pectobacterium, Providencia, dan Pseudomonas.

Soft rot is one of the most important diseases of orchids caused by bacterial pathogens. Bacterial soft rots can be identified by alot of methods. One of the most prominent bacterial pathogens identification methods is nucleotide analysis based on 16S rRNA gene sequence. Optimization of PCR technique to amplify 16S rRNA gene is essential for time and material effieciency, that will make identification to be rapid and more appropriate. The purposes of this study were to (1) decide concentration of DNA and primer, and also concentration of bacterial pure cultures and primer to amplify clear 16S rRNA gene fragment and (2) identify bacterial soft rot of orchid based on 16S rRNA gene sequence. Optimization of PCR was done by using variations of DNA, pure cultures of bacteria, and primer to amplify the 16S rRNA gene sequence. Identification of orchids bacterial soft rot was conducted using nucleotide analysis by BLAST programme at web NCBI to know similarities coevicient between isolates and reference strains in gene bank. The result showed that the most optimal concentration to amplify 16S rRNA gene sequence at DNA and primer concentration were 63,4 ng/μl and 10 pmol, also pure cultures and primer concentration were 8 x 109 CFU/ml dan 10 pmol. Based on BLAST analysis at the gene bank, the bacterial soft rot of orchids have similarities 99-100% with several genera of bacteria such as Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Pectobacterium, Providencia, and Pseudomonas.

Kata Kunci : Analisis filogenetik, bakteri busuk lunak, gen 16S rRNA, optimasi PCR