Determinasi Genetik Staphylococcus aureus Sapi Perah di Baturraden dan Pengembangan Deteksi Stafilokokal Mastitis Langsung dari Susu Segar dengan Polymerase Chain Reaction (PCR)

FATKHANUDDIN AZIZ, Prof. Dr. drh. Siti Isrina Oktavia Salasia,

2013 | Tesis | S2 Bioteknologi

Staphylococcus aureus (S. aureus) merupakan salah satu bakteri penyebab mastitis subklinis yang menyebabkan kerugian ekonomi yang cukup signifikan pada peternakan sapi perah. Staphylococcus aureus dalam susu segar dapat menyebabkan food borne disease. Identifikasi bakteri patogen pada susu segar dapat digunakan untuk diagnosis definitif sumber keracunan pangan, sebagai informasi penting untuk preventif dan kontrol sumber keracunan pangan. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan determinasi genetik S. aureus dan mengembangkan deteksi S. aureus langsung dari susu segar dengan PCR sebagai upaya untuk mendapatkan metode standar untuk skrining kualitas susu secara lebih cepat dan akurat. Dalam penelitian ini digunakan 50 sampel susu segar yang dikoleksi dari sapi perah di Baturraden. Identifikasi S. aureus secara konvensional dilakukan melalui kultur bakteri dan uji mannitol salt agar (MSA), koagulase, katalase, pengecatan Gram dan uji VP. Identifikasi secara molekular dilakukan dengan PCR terhadap 23S rRNA dan gen penyandi determinan virulen yaitu gen coa, nuc, clfA, fnbA, fnbB, cap5, spa IgG dan spa X-region. Hubungan klonal antar isolat dilakukan berdasar analisis AFLP melalui perhitungan unweight pair group method with arithmatic average (UPGMA) dengan membandingkan S. aureus isolat Baturraden dengan isolat wilayah lain. Pengembangan deteksi S. aureus secara langsung dari susu segar dilakukan dengan cara ekstraksi DNA S. aureus langsung dari sampel susu, kemudian dilakukan analisis gen 23S rRNA dengan PCR menggunakan primer spesies spesifik. Sensitifitas dan spesifitas deteksi S. aureus berdasar metode PCR langsung dari susu segar dibandingkan dengan hasil deteksi melalui tahapan kultur bakteri secara konvensional dan molekuler. Hasil penelitian diperoleh 17 isolat positif S. aureus, mempunyai berbagai gen penyandi determinan virulen yaitu gen clfA, coa, spa IgG dan spa X-region (100%), gen cap5 (88%) dan gen fnbB (65%). Hasil analisis AFLP menunjukkan bahwa seluruh isolat S. aureus asal Baturraden mengelompok pada 1 klaster dengan koefisien similaritas 80%. Yang menarik dari hasil penelitian ini diketahui bahwa S. aureus isolat Baturraden BR49 2 dan BR49 3 yang mempunyai kekerabatan dekat (koefisien similarias 100%) diketahui juga mempunyai kesamaan ukuran gen coa (600bp), gen spa X-region (100bp) dan keduanya tidak mempunyai gen cap5. Staphylococcus aureus dapat dideteksi secara langsung dari susu segar dengan metode ekstraksi DNA dan analisis gen 23S rRNA dengan PCR. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan hasil deteksi S. aureus secara langsung dari susu segar dengan hasil uji melalui tahapan kultur bakteri.

Staphylococcus aureus (S. aureus) is one of bacteria that cause subclinical mastitis with significant economic losses in dairy farm. Staphylococcus aureus could also cause bacterial foodborne disease. Identification of the pathogenic bacteria in raw milk can be used for a definitive diagnosis of food poisoning source, it can be used as an important information for preventive and control the source of food poisoning. This research aimed to determine the genetic profiles of S. aureus and to develop the detection of S. aureus directly from raw milk by PCR to get a rapid and accurate method for screening the quality of milk. In this study used 50 samples of raw milk collected from dairy cows in Baturraden. Staphylococcus aureus were identified conventionally based on bacterial culture assays, mannitol salt agar (MSA), koagulase, catalase, VP tests and Gram staining. Staphylococcus aureus were further identified by PCR to determine the 23S rRNA gene and the virulence determinants encoded by coa, nuc, clfA, fnbA, fnbB, cap5, spa IgG and spa X- region genes. The clonal relationship among isolates was carried out based on AFLP analysis through calculation unweight the pair group method with arithmatic average (UPGMA) and compared with S. aureus isolated from other regions. Development of detection of S. aureus directly from raw milk was done by extraction of DNA from raw milk samples, and then analyzed by PCR using primer species specific for 23S rRNA gene detection. The specificity and sensitivity of the detection of S. aureus directly from the raw milk compared with the results of detection of S. aureus through bacterial cultrures conventionally and molecularly. The research resulted 17 isolates positive for S. aureus, could be determined the virulence determinant genes encoded clfA, coa, spa IgG and spa X- region (100%), cap5 gene (88%) and fnbB gene (65%). AFLP analysis showed that all isolates of S. aureus originated from Baturraden could be grouped in 1 cluster with similaritas coefficients of 80%. It was of interest that S. aureus strain BR49 2 and BR49 3 were detected in a close relationship (similarity coefficients of 100%), had also with the size of the coa gene (600bp), spa X-region gene (100bp) and both of strains did not have of cap5 gene. Staphylococcus aureus could be directly identified from raw milk with DNA extraction methods and by PCR analysis of 23S rRNA gene. The results showed that there were no difference between the direct method for detection of S. aureus from raw milk with the detection from bacterial cultures.

Kata Kunci : Staphylococcus aureus, susu, sapi perah, PCR, AFLP