MULTIPLIKASI TUNAS PADA MIKROPROPAGASI TANAMAN TRANSGENIK ANGGREK Phalaenopsis amabilis (L. ) Blume PEMBAWA 35S::KNAT1 PADA MEDIA TANPA FITOHORMON

TRIONO BAGUS SAPUTRO, Dr. Endang Semiarti, M.S., M.Sc.

2013 | Tesis | S2 Bioteknologi

Phalaenopsis amabilis (L.) Blume merupakan salah satu tanaman anggrek asli Indonesia yang memiliki bunga indah sehingga memiliki nilai ekonomi tinggi. Siklus hidup yang lama dan tingkat multiplikasi yang rendah menjadi kendala dalam budidaya anggrek ini secara konvensional. dengan tingkat multiplikasi tunas yang tinggi, telah dilakukan penyisipan gen KNAT1 (Knotted1-like Arabidopsis Thaliana) yaitu gen kunci penumbuh tunas dari tanaman Arabidopsis yang dikontrol dengan promoter 35S ke protokorm P. amabilis. Setelah mengalami regenerasi tujuh kali, perlu dilakukan analisis mengenai keberadaan dan fungsi transgen untuk mendapatkan tanaman P. ambilis yang secara stabil membawa transgen 35S::KNAT1. Metode yang digunakan melalui 3 tahap: 1). Analisis ko-Integrasi transgen 35S::KNAT1 pada genom tanaman P. amabilis. Tahap 1 meliputi seleksi kandidat tanaman transgenik pada medium dasar NP0 (New Phalaenopsis) dan medium induksi tunas (NP SIM) yang ditambah kanamisin. Selanjutnya dilakukan konfirmasi ko-integrasi gen KNAT1 pada genom tanaman P. amabilis dengan teknik PCR 2). pengamatan intensif morfologi tanaman positif transgenik yang meliputi kemampuan multiplikasi tunas, variasi morfologi dan pola venasi. 3). Analisis Profil Protein Tanaman Transgenik. Persentase ketahanan kandidat transgenik terhadap kanamisin pada medium NP0 58,7% dan pada medium NP SIM adalah 62,5%. Hasil PCR menunjukkan bahwa 82,5% kandidat transgenik pada medium NP0 dan 93.33% pada medium NP SIM merupakan positif transgenik. Positif transgenik ditandai dengan teramplifikasinya fragmen DNA gen KNAT1, gen NPTII dan intergenic spacer trnL- F. Keberadaan transgen 35S::KNAT1 dan fitohormon secara independen memacu pembentukan multi tunas pada tanaman transgenik P. amabilis. Terdapat 6 kelompok variasi habitus tanaman, terutama pada bentuk daun, batang dan tunasnya : daun bentuk normal, daun berlobi, daun roset, batang memanjang, tunas membulat, dan daun melebar yang terbanyak adalah tanaman dengan habitus normal (± 29%). Semua sampel tanaman transgenik pembawa 35S::KNAT1 memiliki protein dengan berat molekul 45,8 kDa yang setara dengan protein KNAT1. Data tersebut menunjukkan bahwa transgen 35S::KNAT1 dapat terintegrasi secara stabil dalam genom tanaman transgenik.

Phalaenopsis amabilis (L.) Blume is one of Indonesian natural orchid which has an aesthetic flower so it has a high economic value. The low multiplication rate and long periods of life cycle are the main obstacles to propagate this orchid conventionally. To produce high rate of plant’s multiplication, the KNAT1 (Knotted like Arabidopsis Thaliana) gene of Arabidopsis was inserted into orchid protocorms (developping orchid embryo) under the control of 35S-strong promoter. KNAT1 gene is reported as a gene that involved in the shoot formation, and it had been successfully introduced into Phalaenopsis amabilis (L.) Blume genom. After seven times regeneration, the confirmation of the transgene existence in the genom is needed to ensure whether the secondary growth plant could stably maintain the transgene in its genome or not. The experiment was carried out in 3 steps: 1). Co-integration analysis of 35S::KNAT1 into P. amabilis genom. This step including selection of putative transgenic onto NP0 (New Phalaenopsis) and shoot inducing medium (NP SIM) with addition of of kanamycin. Furthermore, the resistance plants that grow on selection medium then subjected for PCR analysis to ensure whether its harbor the transgene or not. 2). Phenotypic analysis on the multiplication rate, morphological variation, and venation pattern. 3) Protein profile analysis of transgenic plants. The results showed that the survival rate of putative transgenic was 58,7 % on NPO medium and 62.5 % on NP SIM medium. PCR analysis confirmed that 82.5% transgenic growth on NP0 and 93,33% on NP SIM contained DNA fragment of KNAT1 gene, NPTII gene and trnL-F intergenic spacer, indicating that they are positive transgenic. The 35S::KNAT1 transgenes and phytohormone were independently involved in multishoots formation of P. amabilis transgenic plants. The morphological performance was classified into 6 criterias, namely: normal shape, lobed leaves, rossete, elongated stem, cup shoot, and widened leaves. The normal type was the most abundant type of variation (± 29 %) in both medium. Protein profile shows that all transgenic plants produced 45,8 kDa protein and that was equivalent with molecular weight of KNAT1 protein. All those data show that 35S::KNAT1 transgene were stably integrated into the transgenic plant genome.

Kata Kunci : Phalaenopsis amabilis, 35S::KNAT1, multiplikasi tunas