STATUS METILASI GEN BRCA1 GEN BRCA2 EKSPRESI PROTEIN BRCA1 PROTEIN BRCA2 HUBUNGANNYA DENGAN TERJADINYA TUMOR EPITELIAL OVARIUM DERAJAD DIFERENSIASI JENIS HISTOPATOLOGI STADIUM DAN SURVIVAL PENDERITA KANKER EPITELIAL OVARIUM

Heru Pradjatmo, dr.,Sp.OG(K).,M.Kes., Prof. dr. H. Djaswadi Dasuki SpOG(K),

2013 | Disertasi | S3 Kedokteran Umum

Inisiasi dan progresi kanker dikontrol oleh peristiwa genetik dan epigenetik. Kanker berkembang melalui proses yang bertingkat (multistep) dimana genome dari sel-sel kanker baru terjadi mutasi pada beberapa kelompok gen tertentu seperti protooncogen, gen tumor supresor, dan gen-gen lain yang secara langsung maupun tidak langsung mengontrol proliferasi sel. Sel-sel kanker juga punya instabilitas genetik yang memungkinkan sel-sel mendapatkan perubahan lain sepanjang waktu. Proses epigenetik yang banyak diketahui adalah metilasi DNA. Metilasi adalah menambah empat atom pada cytosine salah satu dari empat nukleotid DNA, atom tambahan ini memblok protein yang mentranskrip gen. Beberapa laporan melaporkan metilasi gen BRCA1 pada kanker ovarium bervariasi antara 5 % sampai 65 %, sedangkan metilasi gen BRCA2 belum banyak dilaporkan, dikatakan tingkat metilasi rendah sampai 4 %. Desain penelitian ini adalah prospektif kohort dan penelitian dilakukan di RS Sardjito, Pemeriksaan status metilasi menggunakan metode MS-PCR, dan pemeriksaan ekspresi BRCA1 dan BRCA2 dengan pemeriksaan immunohistokimia jaringan tumor. Tujuan penelitian adalah : 1) Mengetahui status metilasi gen BRCA1 dan gen BRCA2 pada penderita kanker epitelial ovarium. 2) Mengetahui status metilasi tumor suppresor gen BRCA1 dan gen BRCA2 pada sel-sel jaringan kanker epitelial ovarium dibandingkan dengan status metilasi tumor suppresor gen BRCA1 dan gen BRCA2 dari DNA dalam serum darah penderita. 3) Mengetahui apakah status metilasi BRCA1 dan BRCA2 berhubungan dengan stadium, derajad diferensiasi, jenis histopatologi kanker epitelial ovarium. 4) Mengetahui apakah metilasi gen BRCA1 dan gen BRCA2 serta ekspresi protein BRCA1 dan protein BRCA2 berhubungan dengan kemampuan hidup penderita kanker epitelial ovarium. Hasil pengumpulan kasus-kasus dalam penelitian 99 kasus yang terdiri atas 30 kasus tumor epitelial jinak ovarium dan 69 kasus tumor epitelial ganas ovarium dianalisis dalam laporan tesis. Hasil metilasi gen BRCA1 pada jaringan tumor ganas epitelial ovarium yang selsel tumor terdapat metilasi sebanyak 62/69 kasus (89,9 %), yang tidak termetilasi sebanyak 7/69 kasus (10,1 %) dan pada tumor jinak sebanyak 26/30 kasus (86,7%). Pada tumor ganas epitelial ovarium gen BRCA2 yang termetilasi sebanyak 68/69 kasus (98,6 %) dan pada tumor jinak sebanyak 29/30 kasus (96,7 %). Secara statistik tidak berbeda bermakna berturut-turut p = 0,643 dan p = 0,540. Hasil pemeriksaan ini hasil sangat tinggi dan pemeriksaan dilakukan validasi internal maupun eksternal didapat hasil yang sama. Gen BRCA1 dan gen BRCA2 serum yang berhasil diisolasi dari penderita kanker ovarium dan dilakukan pemeriksaan metilasi proporsi metilasinya tidak berbeda bermakna dengan gen BRCA1 dan BRCA2 jaringan berturut-turut p = 0,528 dan p = 0,626. Uji Kappa statistic (agreement) pemeriksaan metilasi gen BRCA1 dan gen BRCA2 pada DNA jaringan dan serum nilai Kappa berturut-turut – 0,035 dan – 0,062. Analisis ini menunjukkan bahwa metilasi gen BRCA1 dan BRCA2 dari DNA serum tidak dapat digunakan untuk mendeteksi adanya metilasi gen dari jaringan tumor. Ini kemungkinan karena primer yang digunakan untuk deteksi fragmen DNA dalam serum terlalu panjang sama dengan yang digunakan untuk jaringan. Dengan analisis regresi logistik multinomial didapat bahwa secara klinis metilasi gen BRCA1, ekspresi protein BRCA1 dan ekspresi protein BRCA2 berpengaruh terhadap jenis histopatologi khususnya jenis adenokarsinoma endometrioid dan clear cell carcinoma, walaupun secara statistik tidak bermakna berturut-turut OR= 3,90 (CI: 0,27 – 54,67), OR = 0,27 (CI: 0,03 – 2,18), OR = 6,95 (CI: 0,83 – 57,99). Metilasi gen BRCA1 dan ekspresi protein BRCA2 berpengaruh secara klinis bermakna tetapi tidak bermakna secara statistik terhadap derajad diferensiasi sedang dan diferensiasi buruk OR = 3,57 (CI: 0,50 – 25,37), OR = 2,16 (CI: 0,47 – 9,90). Metilasi gen BRCA1, ekspresi protein BRCA1 dan ekspresi protein BRCA2 berpengaruh secara klinis bermakna tetapi secara statistik tidak bermakna terhadap stadium lanjut penyakit OR = 2,59 (CI: 0,33 – 20,15), OR = 2,92 (CI: 0,47 – 18, 08), OR = 2,71(0,48 – 15,08). Faktor yang berpengaruh pada survival penderita secara klinis bermakna tetapi secara statistik tidak bermakna adalah ekspresi protein BRCA2 dimana HR 2,04 (CI: 0,61 – 0,677), demikian juga dengan stadium penyakit HR 0,42 (CI: 0,11 – 1,62). Faktor yang berpengaruh bermakna secara statistik adalah umur menarkhe dan kadar CA 125. Kesimpulan: (1) Ditemukan penderita-penderita kanker epitelial ovarium yang dirawat di RS Sardjito status metilasi gen BRCA1 didapat sebanyak 89,9 % penderita dan metilasi gen BRCA2 didapat sebanyak 98,6 % penderita, (2) Proporsi status metilasi gen BRCA1 dan gen BRCA2 dalam jaringan tumor ovarium dengan dalam serum penderita tidak berbeda bermakna dengan probabilitas berturut-turut 0,328 dan 0,237. Hasil pemeriksaan status metilasi gen BRCA1 dan gen BRCA2 dalam serum tidak dapat digunakan sebagai prediktor untuk menentukan status metilasi gen BRCA1 dan gen BRCA2 dalam jaringan tumor ovarium. Dengan nilai kappa statistik berturut – 0,035 dan – 0,062, (3) Secara klinis metilasi gen BRCA1, ekspresi protein BRCA1 dan ekspresi protein BRCA2 berpengaruh terhadap jenis histopatologi adenokarsinoma endometrioid dan clear cell carcinoma, walaupun secara statistik tidak bermakna. Didapat bahwa metilasi gen BRCA1 dan ekspresi protein BRCA2 berpengaruh secara klinis bermakna tetapi tidak bermakna secara statistik terhadap derajad diferensiasi sedang dan difernsiasi buruk tumor. Didapat bahwa metilasi gen BRCA1, ekspresi protein BRCA1 dan ekspresi protein BRCA2 berpengaruh secara klinis bermakna terhadap stadium lanjut penyakit, (4) Metilasi gen BRCA1 dan gen BRCA2 serta ekspresi protein BRCA1 bukan faktor prognosis terhadap survival penderita kanker epitelial ovarium, sedangkan ekspresi protein BRCA2 secara klinis berpengaruh terhadap survival penderita.

Cancer initiation and progression are controlled by genetic and epigenetic events. Cancer develops through multistep process in which the genomes of cancer cells mutate in several groups of genes such as proto-oncogen, tumor suppresor genes and other genes which directly or indirectly control the cell proliferation. Cancer cells also retain genetic instability that allows the cells to change all the time. The epigenetic process which is widely known is DNA methylation. Methylation is adding four atoms in cytosine one of four DNA nucleotides. This additional atom blocks proteins which transcribe the genes. Several study reported that BRCA1 methylation was beetwen 10 % to 65 % and the study of the BRCA2 methylation in ovarian cancer was rare and it was said that methylation was very low up to 4 %. The study design was a prospective-cohort study. The study was conducted at Sardjito Hospital. Methylation status of BRCA1 and BRCA2 genes was examined using MS-PCR methode, and expression of BRCA1 and BRCA2 protein was examined using immunohistochemistry staining to the tumor tissue. The aim of study are: 1) Identifying the methylation status of BRCA1 and BRCA2 genes in patients with epithelial ovarian cancer. 2) Identifying the methylation status of BRCA1 and tumor suppresor genes in the epithelial ovarian cancer tissue cells is compared with the methylation status of BRCA1 and BRCA2 genes fragment of the DNA in the patient’s blood serum. 3) Identifying whether the proportion of BRCA1 and BRCA2 methylation status would affect the stage, the degree of differentiation and the histopathology type of epithelial ovarian cancer. 4) Identifying whether the BRCA1 and BRCA2 gene methylation and protein expression of BRCA1 and BRCA2 were associated with the survival of epithelial ovarian cancer patients. The study result gathering 99 cases which consisted of 30 cases of benign ovarian epithelial tumors and 69 cases of malignant epithelial ovarian tumors was analyzed in this study. The result showed that the methylation status of BRCA1 were 62/68 cases (89.9%) in the benign tumor were 26/30 cases (86,7%). The methylation status of BRCA2 68/69 cases (98,6 %), in the benign ovarian tumor methylation status of BRCA2 were 29/30 cases (96,7 %). Statisticaly no significance different p = 0,643 and p = 0,540 respectively. Seem that these result were very hight, then internal and external validation was done, the result is same. BRCA1 and BRCA2 of the serum that were isoloted was examined the methylation status. The proportion of methylation is not significantly different p =0,528 and 0,626 respectively. However, the Kappa statistic between methylation status in the tissue and serum of BRCA1 and BRCA2 were – 0,035 and – 0,062 respectively. Its mean that methylation status in serum cannot be used to predict methylation status of BRCA1 and BRCA2 in the tissue. It was probably due to the primer that was used to detect DNA fragment in serum was to long same as that was used in the tissue. Multinomial logistic regression analysis found that BRCA1 methylation status, BRCA1 protein expression and BRCA2 protein expression clinically significant influenced to histopathology type espescially endometrioid adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma OR= 3,90 (CI: 0,27 – 54,67), OR = 0,27 (CI: 0,03 – 2,18), OR = 6,95 (CI: 0,83 – 57,99) respectively. BRCA1 methylation status and BRCA2 protein expression clinically significant influenced to the grading of the tumor especially to moderate and poorly differentiated OR = 3,57 (CI: 0,50 – 25,37), OR = 2,16 (CI: 0,47 – 9,90). BRCA1 methylathion status, BRCA1 protein expression and BRCA2 protein expression clinically significant influenced to the stage of diseases especially to late stage OR = 2,59 (CI: 0,33 – 20,15), OR = 2,92 (CI: 0,47 – 18, 08), OR = 2,71(0,48 – 15,08). Factors that clinically influeced to patients survival were BRCA2 protein expression HR = 2,04 (CI: 0,61 – 0,677), stage of diseases HR 0,42 (CI: 0,11 – 1,62). Factors that statistically significant influenced patient survival were the age of menarche and CA 125 conccentration. Conclusions: (1) Methylation status of BRCA1 and BRCA2 genes in the epithelial ovarian cancer were 89,9 % and q 98,6 % respectively, (2) Methylation status of DNA fragmen in the serum patients was not able to use for predicting methylation status of BRCA1 and BRCA2 genes in the ovarian tumor tissue, (3) BRCA1 methylation status, BRCA1 protein expression and BRCA2 protein expression clinically significant influenced to histopathology. BRCA1 methylation status and BRCA2 protein expression clinically significant influenced to the grading of the tumor, (4) BRCA1, BRCA2 genes methylation and BRCA1 protein expression were not as the prognostic factors of the survival of epithelial ovarian cancer patients. However, BRCA2 protein expression clinically influenced to survival of the patients.

Kata Kunci : epithelial ovarian cancer (EOC), methylation, BRCA1, BRCA2, prognosis, survival