PENGEMBANGAN KOMBINASI METODE ONE STEP REVERSE TRANSCRIPTASE-LOOP MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION (RT-LAMP) DAN LATERAL FLOW DIPSTICK (LFD) UNTUK DETEKSI VIRUS PENYAKIT JEMBRANA

Issabellina D. Tampubolon S.Si, Dr. drh. Asmarani Kusumawati, MP.

2013 | Tesis | S2 Bioteknologi

Penyakit Jembrana merupakan penyakit viral pada sapi Bali yang diakibatkan oleh anggota Lentivirus yang disebut virus penyakit Jembrana (Jembrana Disease Virus /JDV), mengakibatkan sindrom penyakit yang bersifat berat dan akut bahkan fatal hingga menyebabkan kematian setelah masa inkubasi yang pendek. Kemunculan penyakit ini tidak hanya terjadi di daerah Bali saja namun juga telah menyebar ke beberapa daerah lain di Indonesia, sehingga sangat diperlukan teknik deteksi dini penyakit Jembrana yang dapat diaplikasikan secara sederhana tetapi memberikan hasil yang spesifik dan sensitif. Pada penelitian ini suatu teknik one step Reverse Transcriptase-Loop Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) dikembangkan dengan melibatkan penggunaan Lateral Flow Dipstick (LFD) sebagai metode pengujian spesifisitas reaksi dan alternatif pengganti elektroforesis gel agarosa sebagai metode analisis hasil reaksi amplifikasi. Optimasi reaksi LAMP yang menggunakan plasmid pGEX-TM rekombinan hasil penyisipan gen env-tm pada plasmid pGEX-2T menunjukkan bahwa reaksi bersifat spesifik, hanya mengamplifikasi DNA target yakni gen env-tm JDV. Hasil ini diperkuat oleh keberhasilan hibridisasi antara amplikon LAMP dengan suatu probe terlabel senyawa 6-Fam (6-Carboxyfluorescein) yang merupakan komplementasi dari beberapa basa nukleotida amplikon LAMP tersebut, yang terdeteksi pada LDF hingga konsentrasi 1 fg/µl, setara dengan 1,52x102 molekul/µl copy number. Teknik ini memberikan hasil positif adanya JDV pada sampel organ berupa limpa, hati, paru dan lidah yang berasal dari sapi eksperimental terinokulasi JDV. Reaksi LAMP ini juga bersifat sensitif, mampu mengamplifikasi DNA dengan konsentrasi 0,1 fg/µl atau 1,52x10 molekul/µl copy number, 100 kali lebih sensitif dari reaksi PCR yang mengamplifikasi DNA dengan konsentrasi 0,01 pg/µl atau 1,52x103 molekul/µl copy number. Kondisi optimal reaksi LAMP yang diperoleh dapat diaplikasikan pada teknik one step RT-LAMP secara sederhana dan singkat untuk mendeteksi keberadaan JDV pada sampel lapangan berupa darah.

Jembrana disease is a viral disease in Bali cattle caused by a member of the Lentivirus called Jembrana disease virus (JDV), causing an acute and severe disease syndrome, even lead to death after a short incubation period. Since it is not only occur in Bali but also has spread to other areas in Indonesia, an early detection technique which can be applied simply but provides a specific and sensitive result is highly required. Development of one step Reverse Transcriptase Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) has been done and in this study it was developed by involving the use of lateral flow dipstick (LFD) as a method of specificity assay of the reaction and as an alternative to replace agarose gel electrophoresis for amplification reaction analysis. Optimization of LAMP has been carried out using pGEX-TM, a recombinant plasmid of pGEX-2T and env tm gene of JDV, showed that the reaction is spesific, only amplify DNA target i.e. env tm gene of JDV. This result was confirmed by the success of hybridization between LAMP amplicon and a 6-Fam (6-Carboxyfluorescein) labeled probe which was detected in the LFD up to concentration 1 fg/ µl, equivalent to 1,52x102 molekul/µl copy number. This technique gives a JDV positive result in organ samples of spleen, liver, lung and tongue which derived from cattle experimentally inoculated JDV. LAMP reaction is also sensitive, could amplifying the DNA concentration up to 0.1 fg/ul or 1,52x10 molekul/µl copy number, 100 time more sensitive than PCR which could amplifying only up to 0.01 pg/ul 1,52x102 molekul/µl copy number. The optimal LAMP reaction can be applied simply and shortly on one step RT-LAMP to detect the presence of JDV in field samples of blood.

Kata Kunci : Jembrana Disease Virus, gen env-tm, RT-LAMP, Lateral Flow Dipstick (LFD), 6-Fam (6-Carboxyfluorescein)