Produksi, Karakterisasi dan Purifikasi Parsial Enzim 5’- Phosphodiesterase (5’-PDE) dari Kecambah Kacang Hijau (Vigna radiata)

ARDHEA MUSTIKA SARI, Dr. Ir. Tyas Utami

2012 | Tesis | S2 Ilmu dan Teknologi Pangan

Enzim 5’-phosphodiesterase (5’-PDE) dapat menghidrolisis asam nukleat menghasilkan senyawa nukleotida. Enzim ini telah berhasil diekstraksi dari berbagai sumber seperti tanaman, hewan dan mikroorganisme, namun tanaman merupakan sumber enzim 5’-PDE yang dianggap lebih aman atau berstatus GRAS (Generally Recognize as Safe) dibandingkan dengan sumber yang berasal dari hewan dan mikrobia. Penelitian sebelumnya menyebutkan adanya aktivitas phosphomonoesterase (PME) pada sumber 5’-PDE yang merupakan kontaminan 5’-PDE sehingga perlu upaya pemurnian untuk memisahkan kedua enzim tersebut. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan enzim 5’-PDE dari kecambah kacang hijau dengan rasio 5’-PDE/PME yang tinggi. Perkecambahan dilakukan selama lima hari pada suhu ruang (29 °C) dan dilakukan pengujian aktivitas 5’-PDE dan PME pada setiap sampel kecambah umur satu hari hingga umur 5 hari. Pengujian aktivitas 5’-PDE dan PME dilakukan menggunakan substrat 10 mM bis-p-nitrophenyl phosphate sodium salt (5’-PDE) dan 30 mM 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate (PME) pada pH 5 dan suhu 60 °C. Purifikasi parsial dilakukan menggunakan presipitasi menggunakan amonium sulfat dengan beberapa tingkat kejenuhan. Hasil presipitasi pada setiap tingkat kejenuhan ammonium sulfat diuji aktivitas 5’-PDE dan PME serta kadar protein terlarutnya menggunakan metode Bradford. Aktivitas 5’-PDE mencapai optimum pada hari kedua perkecambahan dan pada hari yang sama aktivitas PME paling rendah sehingga pada hari kedua perkecambahan diperoleh rasio 5’-PDE/PME yang paling tinggi. Aktivitas 5’- PDE pada hari kedua mencapai 0,465 U/g kecambah sedangkan aktivitas PME pada hari kedua 16,396 U/g kecambah. 5’-PDE dan PME memiliki suhu optimum yang sama yaitu 70 °C. Aktivitas 5’-PDE optimum pada pH 5 sedangkan PME optimum pada pH 4. Pada suhu 60-65°C aktivitas kedua enzim stabil hingga 60 menit inkubasi. Purifikasi dengan presipitasi amonium sulfat 0-70% meningkatkan kemurnian 5’-PDE menjadi 1,41 kali dengan yield 46,24%.

5'-phosphodiesterase (5'-PDE) is an enzyme that hydrolyses nucleic acids to nucleotides. This enzyme has been isolated from various sources such as plant, animal and microorganism. Although 5'-PDE isolated from plants are considered more safe than other sources (animal and microbe) or belong to GRAS (Generally Recognize as Safe) category. It was observed that phosphomonoesterase (PME) was a major contaminating enzyme produced silmutaneously with 5’-PDE. Thus, a purification was conducted to obtain 5’-PDE with low contain of PME.The aims of this present study is to obtain 5’-PDE from germinated mung bean with the highest ratio of 5’-PDE/PME. Mung bean seeds were germinated for 1-5 days at room temperature (29°C). The activity of 5’-PDE and PME in crude extracts prepared from every time of germination were assayed using 10 mM bis-p-Nitrophenyl phosphate sodium salt and 30 mM 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate as a substrate. The enzyme act to this substrate and release the p-nitrophenol that can be measured at 400 nm. The assay of 5'-PDE and PME were conducted at pH 5 and 60 °C. Partial purification was carried out by ammonium sulfate precipitation. Various ammonium sulfate concentration were added to crude extract and every fraction was tested for activity of 5'-PDE and PME and soluble protein using the Bradford method. The crude extract of 2 days germinated mung bean exhibits the highest 5'- PDE activity and the lowest PME activity, so this extract has optimum ratio of PDE / PME. 5'-PDE activity in the second day germination was 0.465 U / g of sprouts while PME activity on the second day germination was 16.396 U / g of sprouts. The optimum temperature for 5'-PDE and PME activity was found to be 70 °C. 5'-PDE activity optimum at pH 5 while PME optimum at pH 4. At a temperature of 60-65 °C the enzymes (5’-PDE and PME) showed good stability up to 60 minutes incubation. Partial purification by ammonium sulfate precipitation of 0-70% increased the purification fold of 5'-PDE to 1.41 with yield of 46.24%.

Kata Kunci : 5’-phosphodiesterase, phosphomonoesterase, kecambah kacang hijau, purifikasi