ACTINOBACTERIA PENGHASIL ANTIFUNGI ASAL RIZOSFER TEGAKAN KAYU PUTIH HUTAN WANAGAMA I YOGYAKARTA: ISOLASI, OPTIMASI DAN KARAKTERISASI ACTINOBACTERIA SERTA ISOLASI SENYAWA ANTIFUNGI

ALIMUDDIN, Prof. drh. Widya Asmara, Ph.D

2013 | Disertasi | S3 Bioteknologi

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengkarakterisasi isolat Actinobacteria dan mengevaluasi keragaman dan potensinya secara in vitro dalam menghambat pertumbuhan fungi uji. Melakukan analisis terhadap sekuen gen PKS dan NRPS serta mengidentifikasi senyawa yang dihasilkan oleh isolat terpilih. Analisis keragaman isolat kayu putih dilakukan dengan metode sidik jari menggunakan rep -PCR dengan primer BOXA1R. Gen target yang mengkode PKS dan NRPS digunakan untuk menyeleksi potensi biosintesis antifungi dari isolat terpilih. Sebanyak 17 diantara 43 isolat yang ditemukan menunjukkan aktivitas untuk menghasilkan senyawa antifungi. Hasil analisis sidik jari rep-PCR menunjukkan adanya 2 klaster yang diperoleh berdasarkan indeks similaritas 70 dan 90%. Satu isolat yang diberi nama Streptomyces sp.GMR22 menunjukkan aktivitas antifungi paling tinggi digunakan sebagai isolat terpilih. Analisis sekuen domain KS terhadap gen biosintesis PKS dari isolat terpilih menunjukkan sekuen identik yang mencapai (59,03%) dengan S. geldanamycininus AB430980. Filogeni A-domain dari NRPS menunjukkan gen target tersebut memiliki kedekatan dengan fragmen S.olivoverticillatus (AB432652) yang mencapai ( 48,56%). Analisis filogeni isolat terpilih tampak bahwa sekuen gen tersebut memiliki kedekatan yang mencapai 96,38% dengan strain acuan S.vayuensis. Hal ini menunjukkan bahwa strain acuan memiliki kedekatan dengan isolat terpilih yang mirip dengan genus Streptomyces. Karakter morfologi isolat terpilih ditandai dengan bentuk spiral tertutup dan berkutil pada ornamen rantai spora. Pengaruh pemberian berbagai sumber karbon dan nitrogen untuk produksi antifungi menunjukkan bahwa amilum merupakan sumber karbon terbaik, sedangkan KNO3 sumber nitrogen paling baik untuk pertumbuhan dan produksi antifungi dari isolat terpilih. Analisis senyawa antifungi yang dilakukan dengan menggunakan pereaksi reagen menunjukkan bahwa senyawa antifungi tersebut termasuk ke dalam golongan senyawa amida makrolida. Selanjutnya, berdasarkan analisis LC-MS yang dilakukan diperoleh adanya ion molekular pada m/z 741,32 yang diduga sebagai be rat molekul senyawa antifungi tersebut. Oleh karena itu, senyawa yang termasuk ke dalam kelompok ansamycin ini memiliki struktur molekular yang mirip dengan naphthomycin K. Nilai KHM antifungi tersebut adalah 62,5 μg/mL terhadap fungi uji C. albicans.

The purpose of this research was to characteriz e of Actinobacteria isolate and evaluate their diversity and potential in vitro with ability in controlling fungal test growth. Analysis of sequences PKS and NRPS gene was conducted and identify of the antifungal subtances producing of selected isolate. The diversity analysis of cajuput isolates were using the fingerprinting was performed by rep- PCR with the BOXA1R primer. Targeting genes encoding PKS and NRPS were used to screen the antifungal biosynthetic potential of the selected isolates. Among 17 of a total 43 of isolates showing activity were screened for producing antifungi substances. The similarity of DNA fingerprints by BOXA1R repetitive sequences of the isolates were revealed two clusters based on index similarity 70% and 90%, respectively. Therefore, could be predicted that the isolates have high diversity relationships and show a positive correlation morphologically type with other isolates and ARDRA analysis. Analysis of the conserved KS domain sequences of the of PKS biosynthetic genes from the selected isolates was displayed highest sequence identity (59.03%) to geldanamycin from S. geldanamycininus AB430980. In the NRPS A-domain phylogeny, fragments of targeted gene appeared to be most closely related to the sequenced fragments of S.olivoverticillatus (AB432652). Phylogenetic analysis of selected isolate (GMR22) was revealed showed 96.38% similarity of S.vayuensis.The effect of various carbon and nitrogen sources of production antifungal was showed that starch as good carbon sources and KNO3 has been shown to be an excellent source of nitrogen for the growth and antifungal production of isolate, respectively. Analysis of the antifungal compound was conducted by reagent showed that the compound belong to the macrolide amide group. Meanwhile, analysis by LC-MS gave molecular ions at m/z 741.32 was predicted as a molecular weight of these antifungal compound. The subtances was including ansamycin group and the molecular structure was suggested similar with naphthomycin K. The MIC value of the compound were 62.5 μg/mL against C. albicans.

Kata Kunci : Actinobacteria , antifungal, rizosfer, kayu putih , Hutan Wanagama