Pengaruh Stress Oksidatif Terhadap Peningkatan Aktivitas ensim AhpC dan Virulensi Mycobacterium tuberculosis Mutan katG Ser315Thr

Ning Rintiswati, Dra.,M.Kes., Prof. Dr. dr. Hardyanto Soebono Sp.KK(K),

2012 | Disertasi | S3 Kedokteran Umum

Tujuan penelitian ini adalah mengetahui pengaruh stress oksidatif terhadap peningkatan AhpC dan hubungannya dengan virulensi M.tuberculosis mutan katG Ser315Thr. Untuk mencapai tujuan penelitian digunakan rancangan penelitian eksperimental laboratorik. Sampel studi berupa isolat M.tuberculosis resisten INH yang merupakan koleksi beberapa laboratorium di Jawa. Identifikasi mutan katG Ser315Thr dilakukan dengan PCR/RFLP yang dikonfirmasi dengan analisis sequencing. Karakteristik fenotip mutan diperiksa, yang meliputi tingkat resistensi INH, kepekaan terhadap obat anti TB yang lain, dan aktivitas katalase. Perlakuan dilakukan dengan menambahkan beberapa konsentrasi H2O2 pada medium pertumbuhan M.tuberculosis. Aktivitas AhpC dievaluasi dengan pengukuran terhadap penurunan t-butil hidroperoksida (TBH) yang merupakan substrat ditiotreitol (DTT) secara spektofotometri, sehingga akan dapat diketahui laju oksidasi DTT. Disamping itu, untuk mengetahui hubungan antara aktivitas AhpC dengan virulensi mutan katG Ser315Thr dilakukan uji pembentukan trehalose 6,6’dimikolat (TDM), uji viabilitas dan kemampuan replikasi isolat uji, serta pengamatan apoptosis makrofag setelah diinfeksi oleh mutan tersebut. Hasil penelitian menunjukkan bahwa katG Ser 315Thr terdeteksi pada 23 isolat diantara 85 isolat uji (27,05%). Risiko bagi mutan untuk resisten terhadap lebih dari satu obat anti TB adalah sebesar lebih dari 4 kali dibanding non mutan, dan di antara 23 isolat mutan katG Ser315Thr 60,1% resisten setidaknya terhadap INH dan rifampisin sehingga dikategorikan sebagai multi drug resisten (MDR). Disamping itu semua mutan Ser315Thr memiliki aktivitas katalase relatif rendah yakni kurang dari sepersepuluh kemampuan non mutan. AhpC mutan katG Ser 315Thr meningkat secara signifikan dibawah perlakuan H2O2 1 mM. Peningkatan AhpC tersebut berpengaruh secara signifikan terhadap replikasi mutan dan penurunan induksi apoptosis makrofag. Disimpulkan bahwa produksi AhpC M.tuberculosis mutan katG Ser315Thr meningkat dibawah pengaruh stress oksidatif. Peningkatan AhpC berkorelasi dengan induksi apoptosis makrofag, dan kemampuan replikasi M.tuberculosis mutan katG Ser315Thr, tetapi tidak berkorelasi dengan pembentukan TDM.

The aim of this study was to evaluate the effectof stress oxidative on increasing of AhpC of katG Ser315Thr of M.tuberculosis, and to examine the correlation between AhpC and the virulence of this mutant. The study design was laboratoric experimental, subjects of study were M.tuberculosis INH resistance clinical isolates collected from Jawa TB laboratories. Isolates were screened for mutation of katGSer315Thr by PCR/RFLP that confirmed by DNA sequence analysis and were characterized on the basis of phenotypic properties (i.e level of INH resistance, susceptibility testing to other TB drugs, catalase activity, and AhpC activity). The treatment were serial dose of H2O2, on liquid culture medium of M.tuberculosis. The AhpC activity of katG Ser315Thr M.tuberculosis strains under oxidative stress condition was evaluated by measured of the rate of dithiothreitol (DTT) oxidation by observed the decrease of t-butyl hydroperoxide spectrophotometrically. The correlation of AhpC activity and the virulence of the strains, were observed by the trehalose 6,6’ dimicolate (TDM) examination, viability and replication competence, and apoptosis induction on human macrophages. The results showed that katG Ser 315Thr were identified in 23 (27,05%) isolates of INH resistance strains. The risk of mutant be resistant to more than one anti TB was more than 4 times compare with non mutant isolates. Among 23 mutant isolates, 60.1 % were resistant to at least INH and rifampin so that they could be categorized as MDR isolates. All mutant isolates showed had low catalase activity.  AhpC of katG Ser 315Thr mutant increased significantly under H2O2 1 mM treatment condition. This AhpC increased have an effect on mutant replication copability and apoptosis human macrophages induction, but no effect on TDM production.   We conclude that the production of AhpC of katG Ser315Thr M.tuberculosis was increased under influence of oxidative stress. The increasing of AhpC was correlated with macrophages apoptosis and the replication capability of the katG Ser315Thr strains.

Kata Kunci : M.tuberculosis mutan katG Ser315 Thr- stress oksidatif -AhpC-virulensi