PEMBUATAN ANTIBODI REKOMBINAN BEGOMOVIRUS ISOLAT CABAI

Yashanti Berlinda Paradisa, Dr.Ir. Sri Sulandari, S.U.

2012 | Tesis | S2 Fitopatologi

Penyakit keriting kuning yang disebabkan begomovirus merupakan salah satu kendala produksi cabai di Indonesia. Penyakit sudah tersebar luas dan sangat sulit dikendalikan. Salah satu cara untuk mencegah timbulnya penyakit antara lain dengan deteksi dini melalui uji serologi. Kendala utama untuk uji serologi begomovirus adalah kesulitan dalam pengadaan virus murni untuk membuat antibodi. Melalui kloning gen penyandi protein selubung begomovirus telah dihasilkan protein rekombinan yang dapat digunakan sebagai imunogen untuk membuat antibodi rekombinan. Penelitian ini bertujuan untuk memproduksi antibodi rekombinan yang dapat digunakan sebagai alat deteksi dini Begomovirus secara lebih akurat, cepat, dan murah untuk mencegah epidemi penyakit keriting kuning. Penelitian dilakukan dengan mengkulturkan plasmid rekombinan PepYLCIV isolat Congkrang. Plasmid rekombinan tersebut diverifikasi melalui analisis PCR dan sekuensing DNA. Plasmid rekombinan dikulturkan dalam media LB cair yang mengandung ampicilin 50μg/ml dan diinduksi dengan IPTG hingga konsentrasi akhir menjadi 1mM untuk mendapatkan protein rekombinan yang selanjutnya digunakan sebagai antigen. Protein rekombinan tersebut diisolasi dan dikarakterisasi secara SDS-PAGE untuk mengetahui berat molekulnya dan digunakan sebagai imunogen. Imunisasi pada kelinci dilakukan dengan dosis 400 μg dan interval penyuntikan 1 minggu. Antiserum yang dihasilkan dimurnikan menggunakan metode almonium sulfat jenuh. Kemurnian antibodi rekombinan dianalisis menggunakan spektrofotometer. Pengujian titer dilakukan menggunakan I-ELISA. Antibodi yang dihasilkan digunakan untuk menguji tanaman cabai dan gulma Ageratum conyzoides terinfeksi menggunakan metode IELISA dan DIBA. Hasil verifikasi melalui analisis PCR dan sekuen DNA menunjukkan bahwa plasmid rekombinan masih mengandung DNA rekombinan PepYLCIV. Ekspresi gen selubung protein dari PepYLCIV menghasilkan pita protein rekombinan yang berukuran sekitar 29kDa. Antiserum yang belum dimurnikan dan antibodi murni yang dihasilkan memiliki konsentrasi masing-masing 0,389mg/ml dan 0,227 mg/ml. Melalui uji secara I-ELISA dan DIBA, Antiserum yang belum dimurnikan dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan begomovirus pada tanaman cabai dan gulma Ageratum conyzoides bergejala keriting kuning.

Pepper yellow leaf curl disease caused by begomovirus is one of Indonesia's pepper production constraints. The disease is widespread and very difficult to control. One way to prevent such diseases by early detection through serological test. The main obstacle for begomovirus serological test is the difficulty in preparing of pure viruses to make antibodies. Through cloning of begomovirus envelope protein-coding genes have been produced recombinant proteins that could be used as an immunogen to create recombinant antibodies. This study aimed to produce of recombinant antibodies that could be used as an early detection of Begomovirus accurately, faster, and cheaper to prevent that disease epidemics. The study was conducted by culturing a recombinant plasmid PepYLCIV isolates Congkrang. Recombinant plasmid was verified by PCR analysis and DNA sequencing. Recombinant plasmids was cultured in liquid LB medium containing ampicillin 50 ug / ml and induced by IPTG until final concentrations became 1mM to obtain the recombinant protein was then used as antigen. Recombinant protein was isolated and characterized by SDS-PAGE to determine the molecular weight and is used as the immunogen. Immunization of rabbits with a dose of 400 μg and the injection of 1-week interval. The resulting antiserum was purified using the method of almonium sulfate saturation. Purity of the recombinant antibodies were analyzed using a spectrophotometer. Titer testing done using the I-ELISA. The resulting antibodies are used to test the pepper plants and weeds Ageratum conyzoides infected using the I-ELISA and DIBA. The results of verification by PCR and DNA sequence analysis showed that the recombinant plasmid still contains the recombinant of DNA PepYLCIV. Expression of coat protein genes a PepYLCIV isolates Congkrang produce a recombinant protein bands measuring approximately 29kDa. Crude antisera and purified antibodies produced has a concentration of respectively 0.389 mg / ml and 0.227 mg / ml. Through the I-ELISA and DIBA test, crude antiserum could be used to detect the presence of begomovirus in pepper plants and weeds Ageratum conyzoides symptomatic yellow curls.

Kata Kunci : Begomovirus, Antibodi Rekombinan, Uji Serologi