PERBANYAKAN TUNAS DENGAN PENYISIPAN GEN KNAT1 PADA ANGGREK HITAM (Coelogyne pandurata Lindl.) MELALUI Agrobacterium tumefac

Rizqie Lingga Nurwulan, Dr. Endang Semiarti, M.S., M.Sc

2012 | Tesis | S2 Bioteknologi

Anggrek Hitam (Coelogyne pandurata Lindl.) merupakan anggrek endemik dari Kalimantan. Anggrek ini memiliki nilai komersial karena keunikan labellumnya yang berwarna hitam. Saat ini, anggrek tersebut telah ditetapkan sebagai anggrek langka akibat maraknya pencabutan liar dan konversi fungsi lahan. Perbanyakan bibit anggrek ini secara konvensional masih belum memadai, sehingga perlu penggunaan teknologi modern untuk perbanyakan massal. Teknologi transgenik dengan penyisipan gen kunci pembentukan tunas akan menjadi terobosan baru. Tujuan penelitian ini adalah untuk meningkatkan kemampuan pembentukan tunas pada Anggrek Hitam melalui transformasi gen KNAT1 menggunakan Agrobacterium tumefaciens. Penelitian ini dibagi menjadi 5 tahapan yaitu: 1. Pemilihan eksplan/ protokorm terbaik dan responsif untuk transformasi; 2. Penentuan medium dasar terbaik untuk perkecambahan biji secara in vitro; 3. Penentuan konsentrasi LC50 Kanamisin terbaik untuk seleksi transforman menggunakan protokorm; 4. Transformasi gen 35S::KNAT1 ke dalam protokorm; dan 5. Analisis fenotip pembentukan tunas pada tanaman transforman 35S::KNAT1. Hasil penelitian menunjukkan bahwa: 1. Fase perkecambahan terbaik sebagai eksplan untuk bahan tanaman target transformasi adalah protokorm fase kedua, embrio berwarna kuning (Yellowish embryo) (berumur dua minggu setelah penaburan); 2. Medium dasar terbaik untuk perkecambahan biji Anggrek Hitam secara in vitro adalah medium 1/2NP karena diperoleh 86% protokorm yang mencapai fase 5 dalam 12 minggu dan tidak ditemukan adanya protokorm yang mati; 3. Konsentrasi LC50 Kanamisin yang digunakan untuk seleksi protokorm transforman adalah 300 mg l-1; 4. Frekuensi regenerasi transformasi gen 35S::KNAT1 ke dalam protokorm sebesar 1,9%; 5. Pembentukan tunas pada Anggrek Hitam transforman empat kali lebih tinggi dan dua kali lebih cepat dibandingkan tanaman non transforman. Serangkaian data tersebut mengindikasikan bahwa penyisipan gen KNAT1 yang dikontrol dengan promoter dari Cauliflower Mozaic Virus 35S dengan perantara Agrobacterium dapat meningkatkan produksi tunas dari embrio Anggrek Hitam. Hal ini sangat menguntungkan untuk perbanyakan massal anggrek tersebut.

Black Orchid (Coelogyne pandurata Lindley) is an endemic orchid from Kalimantan. It has highly commercial value because of the uniqueness of its black labellum. Recently, it has been considered threaten to be extinct due to overcollection and land use conversion. Mass propagation of this orchid using conventional methods is still limited, so that a modern method is needed. For this purpose, transgenic technology with a key gene for shoot induction can be applied. The aim of this research is to improve the capability of shoot formation of the Black Orchid through genetic transformation of KNAT1 gene by Agrobacterium tumefaciens. The research was conducted in 5 steps: 1. Decided the most responsive developing protocorms and the best germination phase of protocorms as the explants for transformation; 2. Determined the best basic medium for in vitro seed germination; 3. Decided the best concentration of LC50 of Kanamycin for transformation selection with protocorms; 4. Transformation of 35S::KNAT1 gene into protocorms; and 5. Phenotypic analysis of shoot formation of 35S::KNAT1 transformant plants. The results show that: 1. The best germination phase of the explants for transformation is the second phase, yellowish embryo (two weeks after sowing); 2. The best basic medium for in vitro seed germination is ½NP medium, in which 86% protocorms grew up to Phase 5. in 12 weeks and there was no dead protocorms found; 3. The concentration of LC50 of Kanamycin used for selection of transformant is 300 mg l-1; 4. The efficiency of genetic transformation of 35S::KNAT1 gene into protocorms is 1.9%; 5. Shoot formation in the Black Orchid transformants is four times higher and two times faster than non transformant plants. These data indicate that Agrobacterium-mediated genetic transformation of KNAT1 gene under the control of Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter improved shoot production from Black Orchid embryo that useful for mass propagation of this orchid.

Kata Kunci : Anggrek Hitam, Gen 35S::KNAT1, Tunas, Agrobacterium tumefaciens, mikropropagasi