KLONING DAN EKSPRESI DAERAH DBL3x dan DBL5ε GEN var2csa Plasmodium falciparum PADA Escherichia coli BL21 (DE3)

Sapto Nugroho Hadi, Prof. Dr. Mustofa, Apt., M.Kes.

2011 | Tesis | S2 Bioteknologi

Malaria is caused by the Protozoan parasite – Plasmodium. Plasmodium falciparum is the most dangerous species among the four malaria species that infect human. Infection by P. falcipafum could lead to death. In 2009, malaria patients in the world reached 225 million with the cases of malaria deaths reached 781,000. Pregnant women have a high risk of malaria infection. Plasmodium falciparum expressed P. falciparum erythrocyte membrane protein-1 (PfEMP-1) on the surface of infected erythrocytes. The protein has been shown to mediate adhesion to host endothelial cells, induce host immune response that correlate with protection to malaria infection. var2csa is the gene encoding the VAR2CSA PfEMP-1 that is mostly expressed in placental isolates. The PfEMP-1 of VAR2CSA type has been shown to mediate the parasite adhesion to the placenta through the abundantly expressed receptor, the chondroitin sulfate (CSA) on the surface of the placenta. Studies aiming to produce vaccine targeting this molecule would provide enormous advantage to the development of agents to block parasite adhesion to the placenta. This study is intended to clone and express the two domain of the var2csa gene encoding PfEMP-1, DBL3x and DBL5ε in Escherichia coli BL21 (DE3). These recombinant fusion proteins will be used as the basis for the development of anti-adhesion-based vaccine in malaria in pregnancy. In this study, the DBL3x and DBL5ε P. falciparum 3D7 strain were subjected to amplification by Polymerase Chain Reaction (PCR). The specific primers were designed to amplify DBL3x (948 bp) and DBL5ε (729 bp) as the target genes. The products were subjected to DNA cloning into the PCR ® 2.1- TOPO ® vector and were propagated in bacterial host cells E. coli strain TOP10. Sequencing result of DBL3x and DBL5ε domains confirmed their sequence similarities with the published database. The NcoI and XhoI restriction sites were introduced by PCR to both DBL3x and DBL5ε to allow ligation into the pET28a (+) expression vector. The expression constructs were subsequently subjected to transformation into E. coli host cells BL21 (DE3). The expressions of recombinant proteins were visualized by SDS-PAGE. The size of the expressed proteins were of 38 kDa and 28 kDa for DBL3x and DBL5ε, respectively. The increased level of the recombinant protein expressions were detectable as the bacteria cultures were induced with 1mM IPTG for up to 4 hours post induction compared to the non-induced controls.

Penyakit malaria disebabkan oleh parasit Protozoa galur Plasmodium. Plasmodium falciparum adalah spesies paling berbahaya di antara empat spesies lain yang menginfeksi manusia. Infeksi oleh P. falciparum dapat menyebabkan kematian. Tahun 2009, penderita malaria di dunia diduga mencapai 225 juta dengan kasus kematian akibat malaria diduga mencapai 781.000 jiwa. Populasi berisiko tinggi terinfeksi malaria adalah wanita hamil. Plasmodium falciparum mengekspresikan P. falciparum erythrocyte membrane protein-1 (PfEMP-1) pada permukaan eritrosit terinfeksi. Protein ini memediasi perlekatan eritrosit terinfeksi ke sel endotelial inang, menginduksi respon kekebalan yang berkaitan dengan perlindungan terhadap infeksi malaria. Salah satu anggota PfEMP-1 adalah VAR2CSA. Protein VAR2CSA memiliki kemampuan untuk memediasi perlekatan parasit kepada plasenta melalui reseptor chondroitin sulfate A (CSA) yang terdapat pada permukaan plasenta. Penelitian yang bertujuan untuk menghasilkan vaksin yang menargetkan molekul ini menjadi penting dalam pengembangan agen yang dapat menghalangi perlekatan parasit pada plasenta. Penelitian ini bertujuan untuk mengkloning dan mengekspresikan dua daerah gen var2csa yang mengkode VAR2CSA, yaitu daerah DBL3x dan DBL5ε pada Escherichia coli BL21 (DE3). Protein fusi rekombinan akan digunakan sebagai langkah awal untuk pengembangan vaksin berbasis anti-perlekatan untuk wanita hamil. Pada penelitian ini, daerah DBL3x dan DBL5ε gen var2csa P. falciparum galur 3D7 diamplifikasi dengan Polymerase Chain Reaction (PCR). Primer yang dirancang spesifik berhasil mengamplifikasi daerah DBL3x (948 bp) and DBL5ε (729 bp). Produk amplifikasi yang diperoleh berhasil dikloning ke dalam PCR ® 2.1-TOPO ® dan diperbanyak di dalam sel inang bakteri E. coli galur TOP10. Hasil sekuensing daerah DBL3x and DBL5ε telah dikonfirmasi memiliki kedekatan mencapai 99% dengan data yang telah dipublikasikan. Situs restriksi NcoI dan XhoI berhasil diintroduksi menggunakan PCR ke dalam sekuen DBL3x dan DBL5ε untuk memungkinkan proses ligasi ke dalam vektor ekspresi pET28a (+). Konstruk ekspresi yang berhasil diperoleh berhasil dikloning ke dalam sel inang E. coli BL21 (DE3). Protein rekombinan hasil ekspresi berhasil divisualisasi dengan SDS-PAGE. Ukuran protein yang diekspresi adalah 38 kDa dan 28 kDa untuk DBL3x dan DBL5ε, secara berturut-turut. Peningkatan jumlah protein rekombinan yang diekspresikan dapat dideteksi sebagai kultur bakteri yang diinduksi pasca penambahan IPTG 1mM selama 4 jam yang dibandingkan dengan kontrol non induksi.

Kata Kunci : Malaria in pregnancy, Plasmodium falciparum, PfEMP-1, var2csa DBL3x, DBL5ε, recombinant DNA, and protein expression.