Induksi mikrospora embriogenik pada tanaman tebu (Saccharum spp.)

SUAIB, Promotor Prof. (Ret) Ir. Woerjono Mangoendidjodjo, M.Sc., Ph.D

2009 | Disertasi |

Mikrospora embriogenik adalah mikrospora yang berada pada suatu kondisi dimana sangat berpeluang untuk berkembang menjadi embrio dan plantlet haploid selama budidaya in vitro. Sampai saat ini, masih susah ditunjukkan bagaimana proses pembelokan arah perkembangan normal mikrospora menjadi polen fungsional ke arah perkembangan abnormal menjadi mikrospora embriogenik pada tanaman tebu (Saccharum spp.). Pembentukan mikrospora embriogenik pada tanaman tebu, perlu dipelajari dan diteliti karena : (1) masih jarang laporan mengenai proses pembentukan mikrospora embriogenik melalui budidaya mikrospora, (2) embrio mikrospora hanya dapat diperoleh apabila mikrospora yang dibudidayakan berada pada keadaan embriogenik, dan (3) embrio mikrospora dan tanaman haploid dan haploid ganda yang dihasilkan bermanfaat bagi aplikasi program pemuliaan tanaman, studi dan manipulasi genetik, pemetaan molekuler, dan seleksi secara in vitro. Disertasi ini melaporkan proses pembentukan mikrospora embriogenik tanaman tebu klon PS862 melalui kombinasi praperlakuan stres medium, suhu dan lama inkubasi mikrospora pada kondisi gelap. Hasil penelitian ini dicapai melalui empat tahap kegiatan, yaitu : (1) menentukan ciri morfologi pertumbuhan malai empat klon tebu (52OC2, 52OC4, PS58, dan POJ3025) yang mengandung lebih banyak individu mikrospora uninukleat; (2) menguji pengaruh kombinasi praperlakuan inkubasi bulir dan cabang malai klon PS862 di dalam dua medium starvasi (medium Kyo dan Harada [B], dan 0,3 M mannitol) dan dua stres suhu (4 oC dan 34 oC) selama 0, 2, 4, dan 7 hari terhadap pembentukan mikrospora embriogenik; (3) menguji tiga metode pewarnaan inti mikrospora (Aceto-carmine, Aceto-orcein, dan DAPI [4’,6- diamidino-2-phenylindole-HCl]) klon PS862, terhadap kemampuan menampilkan inti mikrospora setelah praperlakuan inkubasi di dalam medium starvasi, dan (4) menguji enam medium dasar yang diperkaya dengan 2 mgl-1 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic-acid) atau 2 mgl-1 NAA (Napthalen Acetic Acid) bagi perkembangan embrio mikrospora klon PS862. Hasil penelitian menunjukkan bahwa : (1) ciri morfologi pertumbuhan malai yang mengandung lebih banyak mikrospora uninukleat adalah ketika cabang malai masih terbungkus di dalam kelopak daun bendera bagi klon 52OC2, 52OC4, PS58, dan POJ3025; (2) inkubasi cabang malai klon PS862 di dalam medium Kyo dan Harada pada suhu 34oC selama 2 hari dapat menghasilkan mikrospora embriogenik dan berinti dua simetris, sebagai indikasi awal terjadinya pembelokan perkembangan normal mikrospora menjadi struktur seperti embrio (embryo-like structure) dengan rerata persentase sebesar 79 %; pembentukan mikrospora embriogenik tersebut di atas, ditunjukkan melalui beberapa fase perubahan mulai dari mikrospora viabel uninukleat, bertambahnya ukuran mikrospora, terfragmentasinya vakuola, migrasinya inti pada posisi relatif ke tengah, hingga terjadinya pembelahan inti secara simetris; (3) metode pewarnaan inti mikrospora yang sesuai bagi tanaman tebu klon PS862 adalah metode DAPI yang sebelumnya difiksasi di dalam larutan Carnoy I selama secepat-cepatnya 24 jam pada suhu 4oC dengan penambahan larutan ferric chloride setelah 30 menit pertama fiksasi, dan (4) inkubasi mikrospora embriogenik di dalam medium dasar induksi embrio Gamborg (B5) yang mengandung 2 mgl-1 NAA, dapat menginduksi terbentuknya struktur seperti embrio mikrospora pada tanaman tebu klon PS862.

Embryogenic microspores will likely develop into embryos and haploid plantlets during in vitro culture. However, there is so far no report showing how the normal development of microspores forming functional pollen grains shifts into abnormal development that forms embryogenic microspores in sugarcane (Saccharum spp.). Formation of embryogenic microspore of sugarcane is important to study with three reasons, namely: (1) the development process of embryogenic microspores has rarely been reported right now, (2) the microspore embryo formation would be success if the embryogenic microspores were cultured in vitro, and (3) haploid and doubled haploid embryos and plants produced in vitro microspore culture are useful in the application of plant breeding programs, genetic and manipulation studies, molecular mapping, and in vitro selection. This dissertation reports on the development process of embryogenic microspores in sugarcane clone PS862, through pretreatment combination of stress medium, temperature, and incubation time of microspores in a dark condition. This research was done in four experimental stages. (1) Determination of the morphological characteristics of panicles containing in higher percentages of uninucleate microspores on four sugarcane clones (52OC2, 52OC4, PS58, and POJ3025). (2) Investigation into the effect of pretreatment combinations of spikelets and panicle segments incubation, in two starvation media (Kyo & Harada and 0.3 M mannitol) and two stress temperatures (4oC and 34oC) for 0, 2, 4, and 7 days on the formation of embryogenic microspores. (3) Investigation into the ability of three microspore nuclear staining methods, namely: Aceto-carmine, Aceto-orcein, and DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole-HCl, on a better appearance of the microspore nuclei of sugarcane clone PS862. (4) Investigation into the ability of six embryo induction media supplemented with 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic-acid) or NAA (Napthalene Acetic Acid) on the development of microspore embryos on sugarcane clone PS862. Research results showed that: (1) the unsheathed panicles were the morphological characteristic of panicles of sugarcane clones 52OC2, 52OC4, PS58, and POJ3025 containing in higher percentages of uninucleate microspores; (2) incubation of panicle segments in the Kyo dan Harada medium at 34oC for 2 days led to the formation of embryogenic microspores, with average percentages of 79%. This was presumably an initial indication of the shifting of normal development of microspores into embryo-like structure, (3) the appropriate staining method for the microspore nuclei of sugarcane clone PS862 was the DAPI method, after fixing the nuclei into the Carnoy I solution for at least 24 hours at 4oC with the addition of ferric chloride solution after 30 minutes of incubation; (4) incubation of embryogenic microspores in the B5 embryo induction medium supplemented with 2 mgl-1 of NAA induced the formation of embryo-like structure on microspores of sugarcane clone PS862.

Kata Kunci : Mikrospora embriogenik, Tanaman tebu, Kultur in vitro, Pemuliaan haploid