Aktivitas in vivo, toksisitas akut dan mekanisme aksi in vitro senyawa turunan N-alkil dan N--benzil-1,10-fenantrolin sebagai antiplasmodium

WIJAYANTI, Mahardika Agus, Promotor Prof. dr. Supargiyono, DTMH, SU, SpPar.K., Ph.D

2008 | Disertasi |

Pengembangan obat antimalaria sampai saat ini terus dilakukan untuk mengatasi masalah resistensi terutama plasmodium falciparum yang semakin meluas. Pengembangan senyawa turunan 1,10-fenantrolin sebagai antimalaria untuk mendapatkan senyawa dengan potensi yang lebih baik dan tingkat keamanan yang tinggi telah dilakukan dan didapatkan enam senyawa baru. Senyawa tersebut adalah (1)- N-metil-1,10-fenantrolinium sulfat, (1)-N-etil-1,10-fenantrolinium sulfat, (1)-N-benzil-1,10-fenantrolinium klorida, (1)-N-(4-metoksibenzil)-1,10-fenantrolinium klorida, (1)-N-benzil-1,10-fenantrolinium bromida dan (1)-N-benzil-1,10-fenantrolinium iodida. Enam senyawa baru tersebut masing-masing mempunyai aktivitas antiplasmodium in vitro yang potensial untuk diteliti lebih lanjut. Enam senyawa tersebut pada penelitian ini dikaji secara lebih mendalam dengan tujuan untuk mengetahui seberapa besar aktivitas antiplasmodium secara in vivo pada mencit dan pada primata, toksisitas akut pada mencit dan mekanisme aksi senyawa tersebut dalam membunuh P. falciparum in vitro. Penelitian dilakukan secara eksperimental di dalam laboratorium. Uji aktivitas antiplasmodium senyawa turunan N-alkil dan N-benzil-1,10-fenantrolin terhadap P. berghei in vivo dilakukan dengan metode supresi empat hari. Uji aktivitas antiplasmodium terhadap P. knowlesi dilakukan pada Macaca sp. Uji toksisitas akut dilakukan pada mencit Swiss dengan evaluasi angka kematian pada 24 jam pertama dilanjutkan dengan observasi 14 hari. Mekanisme aksi terhadap P. falciparum in vitro dievaluasi dari interaksi senyawa dengan inhibitor protease E64, penghambatan polimerisasi hematin pada uji HPIA, kemampuan senyawa untuk mempresipitasikan kompleks protein-DNA Plasmodium dan efeknya terhadap kadar enzim laktat dehidrogenase. Aktivitas antiplasmodium in vivo pada mencit Swiss menunjukkan bahwa senyawa turunan N-benzil-1,10-fenantrolin lebih baik daripada senyawa turunan Nalkil- 1,10-fenantrolin dengan nilai ED50 berkisar antara 2,08-47,27mg/kg untuk senyawa turunan N-benzil-1,10-fenantrolin dan 9,34-50,93 mg/kg untuk senyawa turunan N-alkil 10-fenantrolin. Dari enam senyawa yang diuji maka (1)-N-benzil-1,10 fenantrolinium iodida mempunyai aktivitas antiplasmodium in vivo yang paling baik dengan nilai ED50 2,08mg/kg. Senyawa (1)-N-benzil-1,10-fenantrolinium iodida belum berhasil diuji aktivitas antiplasmodiumnya pada primata. Pada penelitian ini infeksi P. kwnolesi pada Macaca nemestrina dan M. fascicularis dapat sembuh sendiri tanpa pengobatan. Dari enam senyawa turunan N-alkil dan N- benzil-1,10-fenantrolin yang diuji maka senyawa (1)-N-benzil-1,10-fenantrolinium iodida mempunyai nilai indeks terapetik paling lebar yaitu 58,38 meskipun nilai ini masih jauh di bawah indeks terapetik klorokuin sebesar 347,85. Hasil uji interaksi terhadap inhibitor protease didapatkan sifat interaksi senyawa turunan N-alkil dan N-benzil-1,10-fenantrolin dengan inhibitor protease E64 berkisar antara sinergis dan aditif dengan nilai CI berkisar antara 0,89±0,18 sampai dengan 1,07±0,18 sedangkan interaksinya dengan klorokuin bersifat antagonis dengan nilai CI berkisar antara 1,28±0,30 sampai dengan 1,56±0,58. Interaksi tersebut menunjukkan bahwa salah satu mekanisme aksi senyawa uji berhubungan dengan proses metabolisme hemoglobin dengan cara menghambat pemecahan globin menjadi asam amino. Aktivitas penghambatan polimerisasi hematin senyawa uji lebih rendah daripada klorokuin. Nilai IC50 HPIA senyawa turunan N-alkil dan N-benzil-1,10-fenantrolin berkisar antara 30,49±1,88mM sampai dengan 59,16±8,71mM, nilai ini lebih tinggi dari IC50 HPIA klorokuin yaitu sebesar 3,49±0,26mM. Kemampuan senyawa turunan Nalkil dan N-benzil-1,10- fenantrolin untuk menghambat polimerisasi hematin bersifat lemah. (1)-N-metil-1,10-fenantrolinium sulfat mempunyai aktivitas presipitasi kompleks protein-DNA yang sebanding dengan (1)-N-etil-1,10-fenantrolinium sulfat dengan angka persentase presipitasi protein 15,08±7,49% dan 15,85±6,43%. (1)-Nbenzil- 1,10-fenantrolinium iodida lebih efektif daripada (1)-N-benzil-1,10-fenantrolinium klorida dengan angka persentase presipitasi protein sebesar 19,35±3,56% dan 8,27±2,56%. Aktivitas klorokuin pada presipitasi kompleks protein-DNA lebih kecil daripada senyawa turunan 1,10-fenanrolin yaitu sebesar 5,27±1,47%. Kadar LDH Plasmodium berkorelasi dengan angka parasitemia. Nilai IC50 senyawa (1)-N-benzil-1,10 fenantrolinium iodida dan klorokuin adalah 305,56±77,62nM dan 4,63±0,48nM. Dari enam senyawa yang diuji dapat disimpulkan bahwa (1)-N-benzil-1,10-fenantrolinium iodida merupakan senyawa yang paling potensial untuk dikembangkan lebih lanjut sebagai obat antimalaria dengan indek terapetik lebar dan mekanisme aksi pada penghambatan enzim protease dan topoisomerase pada Plasmodium.

The development of new antimalarial drugs have now become an important issue in addressing the widespread of resistance parasites. In these studies six new compounds have been synthesized chemically with 1,10-phenantroline chain as the lead compound, those are (1)-N-methyl-1,10-phenantrolinium sulfate, (1)-N-ethyl-1,10-phenantrolinium sulfate, (1)-N-benzyl-1,10-phenantrolinium chloride, (1)-N-(4-methoxybenzyl)-1,10-phenantrolinium chloride, (1)-N-benzyl-1,10-phenantrolinium bromide and (1)-N-benzyl-1,10-phenantrolinium iodide. Preliminary experiment indicating that those six new compounds have an antiplasmodial potency in vitro. This study was focused on evaluation in vivo antiplasmodial activity in mice and primate, acute toxicity in mice and its action mechanism on Plasmodium falciparum in vitro. Experimental studies have been carried out to evaluate the in vivo antiplasmodial activity against P. berghei in Swiss mice by four-day suppressive test. Antiplasmodial activity against P. knowlesi was studied in Macaca sp. Acute toxicity in Swiss mice was evaluated based on mice mortality within 24 hours followed by evaluation within 14 days. The possible mechanism of actions were evaluated by the interaction of those compounds with protease inhibitor E64, whiles the effect on inhibition of hematin polymerization by HPIA assay and its action as topoisomerase inhibitor was evaluated by its ability to precipitate the Plasmodium protein-DNA complex. The effect of those compounds to inhibit lactate dehydrogenase was also evaluated by measuring the concentration of the LDH parasite. The result indicated that N-benzyl-1,10-phenantroline derivatives were more potent than N-alkyl-,10-phenantroline derivatives on in vivo antiplasmodial activity against P. berghei with an ED50 ranged from 2.08 to 47.27mg/kg and 9.34 to 50.93mg/kg respectively. Among those six compounds, (1)-N-benzyl-1,10- phenantrolinium iodide showed the most potent in vivo antiplasmodial activity with an ED50 2.08mg/kg. In vivo antiplasmodial activity of (1)-N-benzyl-1,10-phenantrolinium iodide against P. knowlesi on M. nemestrina and M. fascicularis has not been valuated, as self recuperation occurred when these primates were infected by P. knowlesi. (1)-Nbenzyl-1,10-phenantrolinium iodide has the widest therapeutic index among other compounds tested, TI value was 58.38. Study on interaction of the compounds with protease inhibitor E64 showed that N-alkyl and N-benzyl-,10-phenantrolin derivatives have synergism to additive interaction with CI value ranged from 0.89±0.18 to 1.07±0.18, whereas the interaction against chloroquine was antagonism with CI value ranged from 1.28±0.30 to 1.56±0.58. Those kind of interaction indicated that the mechanism of action of those compounds tested on hemoglobin metabolism occurred through inhibition of globin degradation into amino acids. Activity of the compounds on inhibition of hematin polymerization was lower than that of chloroquine. The IC50 HPIA of N-alkyl and N-benzyl-1,10-phenantroline derivatives were 30.49±1.88mM to 59.16±8.71mM, whereas that of chloroquine was 3.49mM± 0.26mM. The mechanism of action of N-alkyl and N-benzyl-1,10-phenantroline derivatives on hematin polymerization was low. (1)-N-methyl-1,10-phenantrolinium sulfate and (1)-N-ethyl-1,10-phenantrolinium sulfate have equal effectiveness on protein-DNA complex precipitation with percent precipitation of 15.08±7.49% and 15.85±6.43% respectively. (1)-Nbenzyl-1,10-phenantrolinium iodide was more effective on protein-DNA complex precipitation than (1)-N-benzyl-1,10-fenantrolinium chloride with percent precipitation of 19.35±3.56% and 8.27±2.56% respectively. Those results were higher than the activity of chloroquine (5.27±1.47%). Concentration of LDH in the Plasmodium was in correlation with parasitemia. The IC50 of (1)-N-benzyl-1,10-phenantrolinium iodide and chloroquine were 305.56±77.62nM and 4.63±0.48nM respectively. In conclusion among the six new 1,10-phenantroline derivatives, (1)-N-benzyl-1,10-phenantrolinium iodide was the most potent compound for further study on drug development, it has wide therapeutic index, inhibited protease and topoisomerase enzymes of Plasmodium.

Kata Kunci : Antiplasmodium, Obat anti malaria