Optimalisasi prosedur teknik RAPD PCR dalam uji mutu genetik DNA bibit Philodendron sp

BUDIARTI, Sri, Dr. Ir. Aziz Purwantoro, M.Sc

2010 | Tesis | S2 Agronomi

Pemanfaatan penanda molekuler DNA dengan teknik Random Amplified Polimorphic DNA (RAPD) dalam uji mutu genetik merupakan jaminan mutu bagi konsumen. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan prosedur dan kondisi PCR RAPD tahap penempelan primer (annealing) yang optimal serta, untuk memperoleh penanda spesifik yang dapat membedakan jenis dalam spesies Philodendron sp. Penelitian dilaksanakan dari bulan Oktober 2009 sampai April 2010 di Laboratorium Mutu Benih Balai Besar PPMBTPH Cimanggis, Jawa Barat. Sampel penelitian terdiri dari tiga bibit Philodendron sp. yaitu Philodendron Bandung, Philodendron Banten dan Black Cardinal. Metode isolasi DNA yang digunakan adalah CTAB dan Doyle Doyle. Untuk mendapatkan kondisi yang optimal tahap annealing PCR digunakan sembilan variasi suhu dan durasi annealing yaitu 36 ºC selama 60 detik, 36ºC selama 30 detik, 36ºC selama 90 detik, 37ºC selama 60 detik, 37ºC selama 30 detik, 37ºC selama 90 detik, 38ºC selama 60 detik, 38ºC selama 30 detik, dan 38ºC selama 90 detik. Penanda yang digunakan adalah primer OPA 08, OPB 05, OPB 08, OPA 17, OPA 20, dan OPH 16. Visualisasi hasil PCR menggunakan dua konsentrasi gel elektroforesis 1,2 % dan 1,7 %. Hasil isolasi DNA menunjukkan bahwa metode Doyle Doyle menghasilkan kualitas dan kuantitas DNA yang lebih baik daripada metode CTAB. Perlakuan optimal untuk suhu dan durasi annealing dalam proses PCR Philodendron sp. pada 37ºC selama 30 detik, diikuti hasil dari perlakuan yang bertingkat. Pola pita DNA yang jelas dan tegas dihasilkan dari konsentrasi gel elektroforesis 1,2%. Berdasarkan polimorfisme pita DNA, diperoleh primer spesifik untuk Philodendron Banten dengan OPA 08 (200 bp, 300 bp, 400 bp), OPA 20 (800 bp), OPB 05 (850 bp, 1100 bp), Philodendron Bandung dengan OPB 08 (900 bp, 1500 bp) dan Black Cardinal dengan OPH 16 (1200 bp).

Application of DNA molecular marker such as Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) can be used as a quality guarantee for customers related to genetic quality testing. The aim of this research was to find out a procedural and an optimal condition during PCR, especially for the temperature and duration of annealing. In addition a specific marker to determine variety of Philodendron from other was studied. The experiment was conducted from October 2009 until April 2010 at The Seed Quality Laboratory of Balai Besar PPMBTPH in Cimanggis, West Java. Three types of Philodendron sp. namely Philodendron Bandung, Philodendron Banten and Black Cardinal were used as DNA template. DNA was isolated using two methods i.e. CTAB method and Doyle Doyle method. Nine different combinations of temperature and annealing duration were investigated to obtain the optimum annealing for Philodendron. These are 36ºC for 60 sec, 36ºC for 30 sec, 36ºC for 90 sec, 37ºC for 60 sec, 37ºC for 30 sec, 37ºC for 90 sec, 38ºC for 60 sec, 38ºC for 30 sec, and 38ºC for 90 sec. OPA 08, OPB 05, OPB 08, OPA 17, OPA 20, and OPH 16 were used as primers. The electrophoresis of PCR product, gel concentration was made 1.2 % and 1.7 %. The result of DNA isolation showed that Doyle Doyle method was better than CTAB method in DNA quality and quantity. The best annealing temperature and duration of PCR proces for Philodendron sp. are 37 ºC for 30 sec, respectively. Performance of clear and intensive band patterns was obtained when the PCR product was running in electrophoresis using 1.2 % gel consentration. Based on the polimorphism band patterns, OPA 08 (200 bp, 300 bp, 400 bp), OPA 20 (800 bp), OPB 05 (850 bp, 1100 bp) give resulted spesific in Philodendron Banten, OPB 08 (900 bp, 1500 bp) spesific in Philodendron Bandung and OPH 16 (1200 bp) spesific in Black Cardinal

Kata Kunci : Optimalisasi,Annealing PCR RAPD,Philodendron sp