Subkloning dan ekspresi gen penyandi protein rophtry 1 (ROP1) toxoplasma gondii isolat WTA

KUSUMANINGSIH, Purwaningtyas, Prof. Dr. drh. Wayan T. Artama

2010 | Tesis | S2 Bioteknologi

Protein Rhoptry-1 merupakan protein ekskretori dan sekretori (ESA), disekresikan sesaat setelah parasit melekat pada permukaan sel inang dan berperan dalam memodifikasi vakuola parasitoporus serta berpartisipasi dalam interaksi protein. Kloning gen penyandi protein ROP-1 T. gondii isolat RH untuk memproduksi protein rekombinan sebagai perangkat diagnostik atau kandidat vaksin telah banyak diteliti. Namun subkloning dan ekspresi gen penyandi protein ROP-1 T. gondii isolat WTA belum pernah dilakukan. Tujuan penelitian ini ialah untuk mendapatkan subklon yang membawa gen penyandi protein ROP-1 isolat WTA pada vektor pET-32a(+) dan diekspresikan pada E. coli BL21(DE3), sehingga protein rekombinan ROP-1 yang diperoleh dapat diperlajari tingkat spesifitasnya dalam mendeteksi antibodi T. gondii. Gen penyandi protein ROP-1 berukuran ± 1533 bp yang diperoleh dari pemotongan plasmid pWTA-R1 dengan enzim restriksi EcoR I (M1) dan gen penyandi protein ROP-1 berukuran ± 1494 bp produk PCR pWTA-R1 dengan primer R1F4 dan R1R4 (M2) setelah dipotong dengan enzim restriksi EcoR I dan Hind III. Kedua Gen rop-1 tersebut diligasi ke plasmid pET-32a(+) dan ditransformasi ke dalam E. coli BL21(DE3). Pada penelitian ini diperoleh subklon M1 yang membawa insert gen rop-1 berukuran ± 1513 bp dan ± 2105 bp hasil skrening PCR plasmid koloni M1 (pET- 32a(+)/R1), masing-masing dengan primer R1F1/R1R2 dan primer T7 promoter [pET-32a(+)]/R1R2. Protein ROP-1 tidak dapat diekspresikan karena terbentuk dua stop kodon (TGA) sebelum memasuki insert gen rop-1, menyebabkan hanya terjadi proses transkripsi mRNA ROP-1 oleh RNA polimerase T7 pET-32a(+). Ribosom pET-32a(+) tidak dapat mensintesis mRNA menjadi protein ROP-1. Analisis SDS-PAGE protein M1 tidak menunjukkan pita ekspresi protein ROP-1 yang diproduksi secara berlebih berukuran 66 kDa setelah diinduksi IPTG. Produk PCR koloni M2 dan M3 dengan primer promoter T7/terminator T7 pET- 32a(+) diperoleh pita berukuran ± 750 bp, menunjukkan tidak terinsertnya gen rop-1 ke pET-32a(+). Protein yang diekspresikan adalah protein fusi dengan berat molekul 20,4 kDa. Protein rekombinan M1 dan M2 tidak menunjukkan reaksi imunogenisitas spesifik protein ROP-1 dengan berat molekul 66 kDa terhadap poliklonal antibodi anti-ESA.

Rhoptry-1 protein is an excetory and secretory antigen (ESA). This protein (ROP1) is secreted which takes place immediately after adhesions of the parasite to the host cell surface. Cloning gene encoding rophtry-1 (ROP1) protein of T. gondii strain RH to produced recombinant protein and developed it as a diagnostic tool and DNA vaccine has already done. Otherwise, subcloning and expression gene encoding rophtry-1 (ROP1) protein T. gondii WTA isolate never been reported. The aims of these studies was to subclone and express the gene encoding ROP-1 protein T. gondii WTA isolate to produced a recombinant protein ROP-1 in E. coli BL-21(DE3). This protein will be used to perform preliminary studies on its stability to detect T. gondii specific antibodies. A ± 1533 bp fragment of gene encoding ROP-1 protein was digested from pWTA-R1 used EcoR I and amplified from pWTA-R1 used R1F4 and R1R4 primers. Then the rop1 gene inserted into pET-32a(+) and transformed into E. coli BL21(DE3). Analysis of recombinant plasmid and protein were done by PCR, SDS-PAGE and Western-blot. The conclusion of this research produced a subclone M1 that contain a rop-1 gene insert with molecular length of ± 1510 bp and ± 2105 bp, amplified with R1F1/R1R2 and T7 promoter [pET-32a(+)]/R1R2 respectively. Rophtry-1 protein could not expressed in E. coli BL21(DE3), because built two stop codon (TGA) before the gene insert. The T7 RNA polymerase could transcript the mRNA of the rop-1 gene but the pET-32a(+) ribosomes could not translate it into protein ROP- 1. A ± 750 bp band of PCR product of M2 plasmids showed if the plasmid not contain the insert rop-1 gene and plasmid could only expressed fusion protein which has molecular weight 20,4 kDa. Otherwise, the protein M1 and M2 colonies not showed are recognized by polyclonal antibodies anti-ESA.

Kata Kunci : Toxoplasma gondii,Rhoptry1,Toksoplasmosis,Sistem pET,Protein rekombinan,Ekspresi gen, Toxoplasma gondii, Rhoptry1 protein, Toxoplasmosis, pET system, Recombinant protein, Gene expression