Kandidat probe dari sekuen R522 untuk deteksi molekuler toxoplasma gondii

WIDODO, Harto, Dr. drh. Asmarani Kusumawati, MP

2010 | Tesis | S2 Bioteknologi

Adanya sistem deteksi yang cepat, sensitif dan akurat menjadi faktor penting dalam menentukan status kesehatan, diagnosis dan pengobatan suatu penyakit. Toksoplasmosis adalah penyakit disebabkan Toxoplasma gondii yang dapat menyebabkan kematian pada penderita AIDS. Penyakit ini dapat menimbulkan kerugian yang besar karena dapat mengakibatkan abortus, gangguan mental, buta, penurunan produktifitas bahkan kematian pada manusia maupun hewan. Toksoplasmosis pada individu dengan imunokompeten gejalanya tidak menciri dan sering tidak menunjukkan gejala, sehingga diagnosis secara klinis sulit ditegakkan, oleh karena itu perlu pengembangan deteksi dini infeksi T. gondii. Tujuan penelitian ini adalah membuat probe yang berasal dari sekuen repetitive 522 base pair (bp) (R522) T. gondii isolat Indonesia (IS-1) untuk mendeteksi infeksi T. gondii dan menguji spesifisitas dan sensitifitas probe sebagai alat deteksi. R522 diisolasi dari DNA genom takizoit dan diamplifikasi dengan PCR, selanjutnya diklon dalam vektor plasmid dan ditranformasi ke Escherichia coli DH5α. Plasmid rekombinan pCR-TR digunakan sebagai template untuk sintesis probe sepanjang 237 bp (probe TR) yang dilabel dengan digoxigenin menggunakan PCR. Plasmid pCR-TR dapat dideteksi hingga 10 pg melalui hibridisasi dot blot dengan probe TR setelah reaksi enzimatis dengan substrat NBT/BCIP. Berdasarkan analisis BLAST dan hibridisasi dot blot, probe TR memiliki selektifitas yang baik. Probe dapat mendeteksi keberadaan DNA takizoit dengan jumlah minimal 10 ng untuk menghasilkan sinyal dot-blot yang jelas

Rapid, sensitive and accurate detection is essential for determining health status, diagnosis, treatment, and management of diseases. Toxoplasmosis is a disease caused by Toxoplasma gondii which can be fatal for AIDS patients. It emerges some problems: abortus, mental disorder, blindness, decreasing productivity even life-threatening for human and animals. Due to toxoplasmosis in the immunocompetent person is not specific and usually asymptomatic, the diagnosis is hard clinically to accomplish. There is a need, therefore, to develope a tool for initial detection. The aim of this study was to generate probe from a repetitive 522 bp DNA sequence (R522) of an Indonesian T. gondii isolate (IS-1) for detecting T. gondii infection and to examine both its specificity and sensitivity. The R522s were amplified from tachyzoites’ genomic DNA (gDNA) by polymerase chain reaction (PCR) using selected reverse and forward primers. PCR product of R522 was cloned into plasmid vector and subsequently tranformed into DH5α Escherichia coli strain. The recombinant plasmid (pCR-TR) was used as template to synthesize a 237 bp digoxigenin labeled probe (probe-TR) using PCR assay. Probe-TRs were able to detect a little amount of 10 pg of pCR-TR as DNA target through dot blot hybridization after enzimatic detection using NBT/BCIP substrates. BLAST and dot blot hybridization analyses indicated that probe had high specificity in detecting the existence of T. gondii gDNA. Probe could detect tachyzoites DNA at least in amount of 10 ng for sufficient dot blot signal.

Kata Kunci : probe, R522, Toxoplasma gondii, hibridisasi dot-blot, probe, R522, Toxoplasma gondii, dot blot hybridization