Identifikasi bacillus anthracis isolat lokal menggunakan metode konvensional dan polymerase chain reaction

PURNOMO, Cicilia Setyo Rini, Dr. drh. A.E.T.H. Wahyuni, M.Si

2010 | Tesis | S2 Sain Veteriner

Anthrax adalah penyakit zoonosis yang disebabkan Bacillus anthracis dan dapat menimbulkan kerugian yang besar. Spora B. anthracis dapat hidup bertahun-tahun dan menimbulkan letupan penyakit di daerah endemis. Diagnosa yang dilakukan selama ini adalah secara konvensional, namun ada kelemahan diagnosa konvensional anthrax yaitu waktu diagnosa lama, resiko kontaminasi ke lingkungan besar dan sulit membedakan dengan bakteri anthrakoid. Tujuan utama penelitian ini adalah mengidentifikasi B. anthracis isolat lokal dari Boyolali, Sleman, Pati, B. anthracis Weybridge 34F.2 dan B. cereus secara konvensional dan molekuler. Tujuan lain yang mendukung tujuan utama ini adalah mengetahui faktor virulensi B. anthracis isolat lokal dan B. anthracis Weybridge 34F.2, mencari media enrichment, metode inaktivasi dan modifikasi ekstraksi DNA yang paling baik sebelum uji PCR. Identifikasi konvensional dengan cara isolasi di Plat Agar Darah (PAD), identifikasi makroskopis, mikroskopis, uji motilitas dan uji biokimia (katalase, Voges-Proskauer, xylose, arabinose, lactose). Identifikasi molekuler dengan cara uji konvensional PCR. Beberapa media enrichment, metode inaktivasi dan modifikasi ekstraksi DNA dilakukan sebelum uji PCR untuk mengetahui media enrichment, metode inaktivasi dan modifikasi ekstraksi DNA yang paling baik. Enrichment menggunakan Lactose broth dan peptone. Inaktivasi B. anthracis dengan cara perendaman dalam methanol (37 oC, 1 jam), pemanasan dalam autoclave (121 oC) selama 45 dan 15 menit. Modifikasi ekstraksi DNA adalah sesuai protokol High Pure PCR Template Preparation Kit Roche; penambahan 50 μl lysozyme & isopropanol (suhu ruang, 30 menit); penambahan 5 μl lysozyme & isopropanol (-20 oC, ±12 jam); penambahan 50 μl lysozyme, 50 μl SDS 10 % & isopropanol (-20 oC, ±12 jam); penambahan 5 μl lysozyme, 50 μl SDS 10 % & isopropanol (-20 oC, ±12 jam). Hasil identifikasi konvensional menunjukkan morfologi dan sifat biokimiawi B. anthracis mirip dengan B. cereus. Koloni B. anthracis pada PAD tampak tidak hemolisis, putih dan tepi koloni tidak beraturan, sedangkan koloni B. cereus tampak hemolisis dan putih. Pemeriksaan mikroskopis menunjukkan B. anthracis bersifat Gram positif, batang besar, ujung siku - siku, sedangkan B. cereus bersifat Gram positif dan berbentuk batang. Karakteristik biokimia B. anthracis dan B.cereus sama yaitu katalase positif, Voges-Proskauer positif, tidak memfermentasi xylose, arabinose dan lactose. Hasil uji motilitas menunjukkan B. anthracis bersifat non motil dan B. cereus bersifat motil. Enrichment dan inaktivasi B. anthracis yang cukup baik adalah peptone dan autoclave (121 oC, 15 menit). Modifikasi ekstraksi DNA yang baik adalah dengan penambahan 50 μl lysozyme, 50 μl SDS 10 % & isopropanol (-20 oC, ± 12 jam). Hasil uji PCR menunjukkan B. anthracis dari Boyolali, Sleman dan Pati bersifat virulen karena memiliki plasmid pXO1 (toksin) dan pXO2 (kapsul), sedangkan B. anthracis galur Weybridge 34F.2 kurang virulen karena hanya memiliki plasmid pXO2 (kapsul).

Anthrax is a zoonotic disease that is caused by Bacillus anthracis and it can make big loss. Spores of B. anthracis can survive for many years and can make a new case in endemic area. The flaws of conventional methods for anthrax diagnosis are need a long time for diagnosis, big contamination risk for around area and difficult to differentiate with anthracoid bacteries. The main aims of this research are to identify local isolates B. anthracis from Boyolali, Sleman, Pati, B. anthracis Weybridge 34F.2 and B. cereus by conventional and molecular methods. The proponent aims are to detect virulence factors of local isolate B. anthracis and B. anthracis Weybridge 34F.2; find the best enrichment medium, inactivation method and modification of DNA extraction before PCR test. Conventional identifications in this research are isolation on Blood Agar plates, macroscopic identification, microscopic identification, motility test, biochemical test (catalase, Voges-Proskauer, xylose, arabinose, lactose). Molecular identification is conventional PCR test. Some enrichment mediums, inactivation methods and DNA extraction modifications were done before PCR test to find the best enrichment medium, inactivation method and DNA extraction modification. Isolate enrichment were done in Lactose broth and peptone. Inactivation B. anthracis were done by soaking isolate in methanol (37 oC, 1 hour), heating in autoclave (121 oC) for 45 and 15 minutes. Some DNA extraction modifications are DNA extraction that appropriate with High Pure PCR Template Preparation Kit Roche’s protocol, DNA extraction by adding 50 μl lysozyme & isopropanol (room temperature, 30 minutes); by adding 5 μl lysozyme & isopropanol (-20 oC,± 12 hours); by adding 50 μl lysozyme, 50 μl SDS 10 % & isopropanol (-20 oC, ± 12 hours); by adding 5 μl lysozyme, 50 μl SDS 10 % & isopropanol (-20 oC, ± 12 hours). The results of conventional identifications show that morphology and biochemical characteristics of B. anthracis resemble B. cereus. B. anthracis colonies on Blood Agar plates appear non hemolysis, white colonies, and irregular side of colonies. B. cereus colonies on Blood Agar plate appear hemolysis and white colonies. Microscopic identifications show characteristics of B. anthracis are Gram-positive, big rod-shaped with right angle side. Microscopic characteristics of B. cereus are Gram-positive and rod-shaped. B. anthracis and B. cereus have same biochemical characteristics, that are catalase positive, Voges-Proskauer test positive, non-fermented xylose, arabinose and lactose. Motility test show that B. anthracis are motil and B. cereus non motil. The best enrichment medium and inactivation method of B. anthracis are peptone and heating in autoclave (121 oC, 15 minutes). The best DNA extraction modification is DNA extraction by adding 5 μl lysozyme, 50 μl SDS 10 % & isopropanol (-20 oC, ± 12 hours). The result of molecular identifications by PCR test show that B. anthracis from Boyolali, Sleman and Pati are virulent strains because this isolates have toxin-encoding plasmid (pXO1) and capsule-encoding plasmid (pXO2). B. anthracis Weybridge 34F.2 is not too virulent strain because it only has capsule-encoding plasmid (pXO2).

Kata Kunci : Banthracis, B cereus, Enrichment, Inaktivasi, Polymerase chain reaction