Cloning of thermostable DNA polymerase gene from a thermophilic Brevibacillus sp. isolated from Sikidang Crater, Dieng Plateu, Central Java

WITASARI, Lucia Dhiantika, Ir. Irfan D. Prijambada, M.Eng., Ph.D

2009 | Tesis | S2 Bioteknologi

DNA polimerase termostabil memiliki peran penting d alam penelitian biologi molecular, yaitu untuk mengamplifikasi DNA dalam proses polymerase chain reaction (PCR). DNA polimerase termostabil di ekspresikan oleh mikroorganisme termofilik. Bakteri termofilik Brevibacillus sp. berhasil diisolasi dari sumber air panas kawah Sikidang Dieng, Jawa Tengah. Penelitian awal menunjukkan bahwa crude protein dari isolat Brevibacillus sp . diketahui dapat digunakan dalam PCR. Seperti halnya enzim termostab il alamiah, DNA polimerase pada isolat disintesis dalam jumlah yang sedikit da n membutuhkan teknik purifikasi yang rumit. Tujuan penelitian ini adalah melakukan kloning gen DNA polimerase dari isolat . Penelitian diawali dengan melakukan amplifikasi bag ian gen DNA polimerase pada genom isolat menggunakan primer spe sifik. Fragmen yang teramplifikasi kemudian diisolasi, dimurnikan dan d iligasi pada vektor kloning pGEM-T. Rekombinan plasmid kemudian ditransformasi ke sel coli JM109 kompeten dengan metode kejutan panas. DNA vektor re kombinan kemudian dilakukan karakterisasi terhadap sekuen basa nukleo tida. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa gen DNA Pol I termostabil berhasil diamplifikasi dari DNA genom isolat mengha silkan fragmen berukuran ± 2,7 kb. Plasmid rekombinan yang membawa fragmen ber hasil diklon ke dalam bakteri E. coli JM 109. Analisis sekuen pada fragmen menunjukkan t ingkat kesejajaran yang tinggi dengan gen DNA polimerase t ermostabil pada bakteri Bacillus lain.

Thermostable DNA polymerase has an important role i n molecular biology research to amplify small amount of DNA thr ough polymerase chain reaction (PCR). Thermostable enzymes are expressed by thermophillic microorganisms. Thermophillic bacteria Brevibacillus sp. has been isolated from Sikidang Crater, Dieng Plateu, Central Java. Previo us study showed that crude protein of the isolate could be used in PCR. Unfort unately, like most native thermostable enzymes, the thermostable DNA polymera se of the isolate is synthesized in a very low level and therefore is cu mbersome to purify. The purpose of this research is to clone thermostable D NA polymerase gene of the isolate. The DNA polymerase gene of the isolate was amplifie d by PCR method using spesific primers. The amplified fragment was then isolated, purified, and ligated into the pGEM-T cloning vector. The recombi nant plasmid was then transformed to competent E. coli JM109 cells using heat shock method. The cloned thermostable DNA polymerase gene from the th ermophilic isolate is then characterized for its nucleotide base sequence. The result showed that the DNA Pol I gene was succe ssfully be amplified from the isolate DNA genom, resulting in ± 2,7 kb sequence in length. Recombinant plasmid carrying the fragment could be cloned into E. coli JM 109. Sequence analysis of segment of targeted gene showe d high similarity to that of thermostable DNA polymerase genes from other Bacillus.

Kata Kunci : Thermostable DNA pol I,Brevibacillus sp,PCR,Cloning ; Thermostable DNA Pol I, Brevibacillus sp ., PCR, cloning