Analisis Toxoplasma gondii repeat region 529 bp (NCBI Acc.No. AF146527) sebagai kandidat probe untuk diagnosis molekuler toksoplasmosis

PRATAMA, Dyah Ayu Oktavianie Ardhiana, Prof. Dr. drh. Wayan T. Artama

2009 | Tesis | S2 Bioteknologi

Toksoplasmosis merupakan penyakit yang disebabkan oleh protozoa Toxoplasma gondii. Infeksi Toxoplasma umumnya tidak menimbulkan gejala sakit (asymptomatic), sehingga perlu adanya suatu metode deteksi dini yang konfirmatif dan akurat. Alternatif sistem deteksi yang efektif adalah metode molekuler untuk mendeteksi asam nukleat agen patogen. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan suatu metode diagnosis toksoplasmosis secara molekuler berdasarkan T. gondii repeat region 529 bp yang bersifat high copy number dan conserved sebagai probe DNA dengan aplikasi metode hibridisasi. Dalam penelitian ini, DNA diisolasi dari takizoit T. gondii isolat lokal yang diperbanyak secara in vivo pada mencit strain Balb/c. Repeat region genom T. gondii yang didapat dari GeneBank diamplifikasi dengan menggunakan forward primer 5’- GAC TCG GGC CCA GCT GCG -3’ dan reverse primer 5’- CCT CTC CTA CCC CTC CTC -3’ dengan menggunakan DNA takizoit sebagai template. Polymerase Chain Reaction dilakukan menggunakan PuRe Taq Ready To GoTM PCR Beads (Amersham Biosciences) yang mengandung Taq polymerase. Produk PCR dielektroforesis dengan agarose gel 1% dan dilakukan isolasi DNA monomorfik. Analisis DNA monomorfik dilakukan dengan sekuensing menggunakan metode Big Dye Terminator. Analisis sequence untuk seleksi calon probe dilakukan dengan memperhatikan syarat-syarat ideal suatu probe. Sequence probe T. gondii berdasarkan hasil analisis dipesan di industri (Sigma-Aldrich), menghasilkan probe sepanjang 103 bp. Pelabelan probe dilakukan menggunakan digoxigenin-11-dUTP sebagai reporter hibridisasi. Deteksi T. gondii dilakukan dengan metode hibridisasi antara probe T. gondii dengan DNA sampel lapangan yang diisolasi dari darah. Hasil penelitian menunjukkan probe toxo-103 bp yang disusun berdasarkan T. gondii repeat region 529 bp memiliki spesifisitas yang tinggi pada parasit T. gondii (berdasarkan analisis BLAST), dan mampu mendeteksi DNA komplementernya dalam sampel klinis hingga konsentrasi 10 ng/μl.

Toxoplasmosis is a disease caused by protozoan parasite Toxoplasma gondii. The infection is commonly asymptomatic. The availability of confirmative and accurate detection system is really needed. The alternative for toxoplasmosis diagnosis is molecular method which aimed to detect the nucleic acid of infectious agent. This research was aimed to develop a molecular diagnosis method to detect toxoplasmosis based on the conserved and high copy number repeat region of Toxoplasma gondii with hibridization method. Nucleic acid was isolated from tachyzoites. The repeat region of T. gondii was amplified using PuRe Taq Ready To Go-PCR Beads (Amersham Bioscience), forward primer 5’- GAC TCG GGC CCA GCT GCG -3’ and reverse primer 5’- CCT CTC CTA CCC CTC CTC -3’. The amplicon was sequenced using Big Dye Terminator method. Probe candidate was design based on the analysis of the sequences, produces the 103 bp length of probe. Probe was labeled using digoxigenin-11-dUTP. Application of probe to detect T. gondii was done by hibridization method. The research concluded that probe toxo-103 bp was highly homolog with several strain of T. gondii. Hybridization analysis showed that probe could detect the complementary nucleic acid up to 10 ng/μl concentration.

Kata Kunci : Probe DNA,Repeat region,Toxoplasma gondii,Hibridisasi, DNA probe, repeat region, Toxoplasma gondii, hybridization