Subkloning dan ekspresi gen penyandi protein mikronema 3 (Mic-3) Toxoplasma gondii isolat lokal

INDRASANTI, Diana, Prof. Dr. drh. Wayan T. Artama

2009 | Tesis | S2 Bioteknologi

Protein mikronema (MIC) merupakan salah satu protein yang termasuk dalam excretory-secretory antigens (ESAs) pada Toxoplasma gondii. Protein mikronema 3 (MIC-3) merupakan protein yang berperan penting dalam proses invasi, yaitu sebagai perantara perlekatan parasit pada sel inang. Rekombinan protein MIC-3 telah digunakan untuk deteksi toxoplasmosis pada beberapa penelitian, dimana protein ini mampu menginduksi respon imun humoral dan seluler pada hewan percobaan. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan ekspresi protein rekombinan MIC-3 T. gondii isolat lokal melalui pendekatan teknologi DNA rekombinan dengan melakukan kloning gen penyandi protein MIC-3 ke dalam vektor ekspresi. Amplifikasi DNA takizoit T. gondii dilakukan menggunakan PuRe Taq RTG-PCR Beads dengan primer spesifik untuk mic3. Pemotongan DNA hasil amplifikasi menggunakan restriksi endonuklease EcoRV dan HindIII, kemudian dilakukan purifikasi menggunakan EZ-10 spin coloumn purification kit. Insert mic3 diligasi pada vektor ekspresi pET-32a(+) dan ditransformasi ke dalam Escherichia coli BL21 dengan teknik heat shock. Bakteri rekombinan dikultur pada LB agar yang mengandung ampisilin. Koloni putih (koloni pembawa DNA rekombinan) ditumbuhkan dalam media LB cair yang telah ditambahkan ampisilin. Identifikasi plasmid rekombinan dilakukan dengan isolasi plasmid menggunakan metode lysis alkali dan diamplifikasi kembali, selanjutnya dielektroforesis menggunakan gel agarose 1%. Ekspresi protein dilakukan dengan menumbuhkan bakteri rekombinan dalam media LB cair yang telah ditambahkan ampisilin dan IPTG, selanjutnya bakteri disonikasi untuk mendapatkan protein rekombinan MIC-3 dan dilakukan immunoblotting menggunakan antibodi poliklonal anti ESA. Hasil penelitian menunjukkan bahwa transformasi plasmid rekombinan pada E. coli BL21 menghasilkan satu koloni yang membawa gen penyandi protein MIC-3. Produksi antibodi poliklonal anti ESA untuk identifikasi protein rekombinan juga telah dilakukan. Kesimpulan penelitian adalah ekspresi protein rekombinan MIC-3 dengan BM ~108 kDa berhasil diperoleh melalui kloning gen penyandi protein MIC-3 T. gondii isolat lokal ke dalam pET-32a(+) dan ditransformasi pada hospes E. coli BL21 yang dapat diidentifikasi dengan antibodi poliklonal anti ESA.

roneme protein (MIC) is one of proteins that belongs to excretorysecretory antigens (ESAs) of Toxoplasma gondii. Microneme 3 protein (MIC-3) is the protein that plays an important role in the invasion proccess during cell infection as a mediator attachment parasite to the host cell. Recombinant MIC-3 protein has been already used for detection of toxoplasmosis and it could induce humoral and cellular immune response in experimental animal. The aim of this research is to express MIC-3 protein of T. gondii from local isolate using recombinant DNA technology by cloning of the gene encoding for MIC-3 in an expression vector. Deoxyribonucleic acid from T. gondii tachyzoites was amplified by PuRe Taq RTG-PCR Beads using mic3 specific primers. Amplified DNA was double digested using EcoRV and HindIII restriction endonucleases and then purified using EZ-10 spin column purification kit. The mic3 DNA was ligated into pET- 32a(+) expression vector and transformated into Escherichia coli BL21 using heat shock method. Recombinant bacteria were cultured on ampicillin containing LB plate. White colony (recombinant colony) was picked up and grown in ampicillin containing LB medium. Identification of recombinant plasmid was performed by plasmid isolation using alkaline lysis method. Then, it was amplified again and run on a 1% agarose gel. Protein expression was performed by culturing recombinant bacteria into LB medium containing ampicillin and IPTG. Recombinant protein was isolated by sonication method and identified using SDSPAGE. Finally, the recombinant protein was analyzed by immunoblotting using anti-ESA polyclonal antibody. The results of the study showed that transformation of recombinant plasmid into E. coli BL21 produce one colony that bring gene encoding MIC-3 protein has been successfully done. The production of antibody polyclonal anti ESA has also been done. In conclusion, expression of the mic3 gene with ~108 kDa has been successfully performed by cloning gene encoding for MIC-3 protein of T. gondii local isolate into pET-32a(+) and transformed to E. coli BL21 that can be identified with polyclonal antibody anti ESA.

Kata Kunci : Toxoplasma gondii,Subkloning,Ekspresi,Protein MIC,3,