Isolasi, karakterisasi dan uji diagnostik protein rekombinan GRA-1 takizoit toxoplasma gondii isolat lokal

UTAMI, Wiwien Sugih, Prof. Dr. Wayan T. Artama

2009 | Tesis | S2 Ilmu Kedokteran Tropis

Protein GRA adalah komponen antigen ekskretori sekretori (ESA) yang dihasilkan oleh organella sekretori Toxoplasma gondii dan berperan dalam proses invasi ke dalam sel hospes. Antigen GRA-1 dapat menginduksi respon imun humoral dan seluler pada mencit dan manusia. Penyediaan protein GRA-1 menggunakan cara isolasi T. gondii jumlahnya sangat terbatas, disamping penanganan takizoit yang relatif tidak aman serta mahal, hal ini dapat dipenuhi melalui teknologi rekombinan DNA. Tujuan penelitian ini adalah untuk membuktikan bahwa protein rekombinan GRA-1 takizoit T. gondii isolat lokal yang telah di isolasi dan di karakterisasi dapat digunakan untuk diagnosis toksoplasmosis akut dengan cara mendeteksi antibodi anti Toxoplasma dalam serum. Protein rekombinan GRA-1 diproduksi dan diperbanyak dengan cara rekultur isolat bakteri E.coli BL21 yang mengandung plasmid rekombinan GRA- 1. Hasil rekultur ini di sonikasi dan supernatannya adalah protein rekombinan GRA-1, kemudian dilakukan karakterisasi dengan cara elektroforesis pada SDSPAGE dan imunobloting menggunakan antibodi spesifik T.gondii. Hasil penelitian menunjukkan bahwa protein rekombinan GRA-1 dapat di isolasi dan dikarakterisasi menggunakan elektroforesis pada 24 kDa serta dikenali oleh antibodi spesifik anti T.gondii melalui imunobloting. Kinerja IgM ELISA GRA-1 didapatkan sensitivitas 94,12%; spesifisitas 94,12%; PPV 94,12%; NPV 94,12%; LR+ 16 dan LR- 0,0625 dan IgG ELISA GRA-1 didapatkan sensitivitas 94,12%; spesifisitas 100%; PPV 100%; NPV 94,44%; LR+ 0; LR- 0,0588. Analisis kurva ROC untuk IgM menunjukkan sensitivitas tinggi (0,941), nilai positif palsu rendah (0,59) dan nilai AUC yang baik (0,976) sedangkan IgG menunjukan sensitivitas tinggi (0,941), tidak ada nilai positif palsu (0,0) dan nilai AUC yang mendekati sempurna (0,997). Infeksi primer menggunakan ELISA GRA-1 14,63% sedangkan dengan ELISA Kit 4,88%. Infeksi lampau terdeteksi lebih sedikit (7,32%) dibandingkan ELISA Kit (46,34%). Status infeksi aktif terdeteksi dengan ELISA GRA-1 90,24% dan ELISA Kit 34,15%. Hasil ini semakin membuktikan bahwa pemeriksaan serologi menggunakan ELISA GRA-1 lebih sensitif dan lebih spesifik dibandingkan dengan ELISA Kit. Tes Kappa antara ELISA GRA-1 dan ELISA Kit tidak ada kesesuaian untuk IgM, sedangkan untuk IgG ada sedikit kesamaan. Hasil ini sesuai dengan hasil tes Fisher’s Exact dan uji beda proporsi. Kesimpulan protein rekombinan GRA-1 dapat digunakan untuk pemeriksaan serologis toksoplasmosis terutama untuk mendeteksi toksoplasmosis akut karena lebih sensitif dan lebih spesifik dibandingkan dengan ELISA Kit.

Granule protein is a major component of excretory and secretory antigen (ESA) secreted by organelles Toxoplasma gondii, and these protein play an important role during the invasion of the parasites into the host cells. The GRA-1 protein induced humoral and cellular immune responsof the host. The availability of GRA-1 protein for the purposed diagnosis is very limmited, therefore over expression of Gra-1 by sub clone of the coresponding gene in the pET 32a will be very benificial for aim of diagnostic development. The aim of this research was to identify that GRA-1 protein of T. gondii has a valuable tool for early diagnosis of Toxoplasmosis.. The GRA-1 recombinant protein produced, and multiplied by cultured bacterial isolate E.coli BL21 consist a recombinant plasmid GRA-1. Furthermore the re-cultured recombinant treated with sonication and its supernatant were recombinant protein GRA-1, after that the result characterized by electrophoresis on SDS-PAGE and immunoblotting used with specific T.gondii antibody. The results showed that recombinant GRA-1 protein could be isolated and characterized with electrophoresis 24 kDa and detected by its specific antibody anti T.gondii through immunoblotting. Characteristic performance of IgM GRA-1 ELISA showed sensitivity 94.12%; specificity 94.12%; PPV 94.12%; NPV 94.12%; LR+ 16 and LR- 0.0625 and from IgG GRA-1 ELISA showed sensitivity 94.12%, specificity 100%; PPV 100%; NPV 94.44%; LR+ 0 and LR- 0.0588. The ROC curve analysis for IgM shown a high sensitivity (0.941), the false positive value were low (0.59) while the AUC value was good (0.976) while IgG shown a high sensitivity (0.941), there were no false positive value (0.0) and the AUC value with nearly perfect (0.997). The acute infection used with GRA-1 ELISA was 14.63% while ELISA Kit 4.88%. The chronic infection was lower (7.32%) compared with ELISA Kit (46.34%). The active infection status detected by GRA-1 ELISA was 90.24% and ELISA Kit 34.15%. From these results showed that serology examination used with GRA-1 ELISA would be more sensitive and specific than ELISA Kit. The kappa test between GRA -1 ELISA and ELISA Kit seem no similarity with IgM, while for IgG seem a little similarity. These results relevance with Exact Fisher’s test and difference proportion test. In conclusion showed that recombinant protein GRA-1 could be used for serologic examination on serologic toxoplasmosis, especially to detect an acute toxoplasmosis, since the preparation was more sensitive and specific than ELISA Kit.

Kata Kunci : toksoplasmosis,Protein rekombinan GRA,,uji diagnostik,toxoplasmosis - recombinant protein GRA-1- diagnostic test