Analisis sekuen 16S rRNA dan kemampuan ekskresi amonium pada isolat-isolat bakteri penambat introgen yang diisolasi dari tanah mineral masam

HARTONO, Ir. Jaka Widada, MP., Ph.D

2009 | Tesis | S2 Bioteknologi

Bakteri penambat nitrogen (N2) adalah bakteri yang dapat mengkonversi molekul N2 bebas di atmosfer menjadi amonium melalui reduksi elektron dan protonasi gas N2 dengan menggunakan enzim nitrogenase. Beberapa spesies bakteri penambat nitrogen diketahui memiliki kemampuan mengekskresikan amonium hasil penambatan nitrogen. Fenomena ini diharapkan dapat meningkatkan kontribusi bakteri penambat nitrogen dalam menyediakan senyawa nitrogen tersedia bagi tanaman. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi dan mendapatkan bakteri penambat nitrogen yang memiliki kemampuan mengekskresikan amonium dengan konsentrasi tinggi. Sejumlah 15 (lima belas) isolat bakteri penambat nitrogen yang diisolasi dari tanah mineral masam dianalisis keragaman genetiknya menggunakan teknik Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA) untuk mendapatkan isolat bakteri terpilih. Isolat bakteri tersebut selanjutnya dideteksi potensi penambatan nitrogennya pada aras genetik dengan mengamplifikasi gen nifH melalui teknik Polymerase Chain reaction (PCR) dan aktivitas enzim nitrogenase menggunakan metode Acetylene Reduction Assay (ARA). Kemampuan isolat bakteri terpilih dalam mengekskresikan amonium dianalisis secara kualitatif dengan pereaksi warna Nessler, sedangkan pengujian secara kuantitatif dilakukan dengan metode spectrophotometry. Semua isolat bakteri terpilih diidentifikasi secara molekular melalui analisis sekuen gen 16S rRNA untuk mengetahui posisi taksonominya. Analisis keragaman genetik pada isolat-isolat bakteri penambat nitrogen menghasilkan delapan isolat bakteri terpilih yang digunakan untuk pengujian selanjutnya. Gen nifH berhasil diamplifikasi dari semua isolat bakteri terpilih. Hasil analisis aktivitas nitrogenase menunjukkan enam isolat bakteri memiliki kemampuan penambatan nitrogen tinggi yaitu GMA3, GMA5, GMA6, GMA9, GMA12 dan GMA13. Hasil analisis ekskresi amonium menunjukkan empat isolat bakteri memiliki kemampuan mengekskresikan amonium dengan konsentrasi tinggi yaitu GMA1, GMA3, GMA6 dan GMA9. Analisis sekuen gen 16S rRNA menunjukkan bahwa isolat GMA3, GMA5, GMA11, dan GMA12 masing-masing memiliki hubungan kekerabatan yang dekat dengan Brevibacillus formosus strain DSM 9885T, Flexibacter canadensis strain ISSDS-428, Rhizobium tropici strain rif 200849 and Azotobacter tropicalis strain RBS, isolat GMA1 dan GMA13 memiliki hubungan kekerabatan yang dekat Sthenotropphomonas sp. Strain MFCC, sementara isolat GMA6 dan GMA9 memiliki hubungan kekerabatan yang dekat Azotobacter vinelandii strain ISSDS-428.

Nitrogen fixing bacteria defines as bacteria which is capable to transform free nitrogen molecule into ammonium via electron reduction and gaseous protonation using nitrogenase enzyme. Several of these bacteria are known to have ability on ammonium excretion which is produced via nitrogen fixation. This phenomenon considered to increase bacteria nitrogen fixation contribution to provide available nitrogen for crop. The aim of this research was to identify and obtain nitrogen fixing bacteria which produced high level of ammonium via excretion process. Total of 15 isolates of nitrogen fixing bacteria have been isolated from acid mineral soil and subsequently screened using Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA) to obtain selected isolates. Nitrogen fixation ability of these selected isolates is detected by nifH gene via Polymerase Chain Reaction (PCR). Nitrogenase activity of these selected isolates was measured using Acetylene Reduction Assay (ARA). The ability of these selected isolates in ammonium excretion was qualitatively and quantitatively measured using Nessler Reagent and spectrophotometry method respectively. Taxonomic position of the selected bacteria were determined based on their 16S rRNA sequence analysis. Genetic diversity analysis of these 15 isolates of nitrogen fixing bacteria yield eight selected bacteria for subsequent analysis. Sequence of nifH gene from all of these selected bacteria were succesfully amplified. Nitrogenase assay of these selected bacteria revealed 6 isolates with high nitrogen fixation capacity namely GMA3, GMA5, GMA6, GMA9, GMA12 and GMA13. Ammonium excretion analysis revealed 4 isolates which has remarkable ability of producing high level of ammonium namely GMA1, GMA3, GMA6 and GMA9. The 16S rRNA sequence analysis shown that isolate GMA3, GMA5, GMA11 and GMA12 had a closed relation with Brevibacillus formosus strain DSM 9885T, Flexibacter canadensis strain ISSDS-428, Rhizobium tropici strain rif 200849 and Azotobacter tropicalis strain RBS respectively, isolate GMA1 and GMA13 had a close relation with Sthenotropphomonas sp. Strain MFC-C, while isolate GMA6 and GMA9 had a close relation with Azotobacter vinelandii strain ISSDS-428.

Kata Kunci : Bakteri penambat nitrogen,Ekskresi amonium,Identifikasi,nitrogen fixing bacteria, ammonium excretion, identification