Bakteri khitinolitik sebagai agensia pengendalian hayati nematoda sista kuning (Globodera rostochiensis) :: Isolasi dan karakterisasi enzim khitinase Bacillus sp.D2

BEHAR, Chatarina Gennydd Karandja Hupa, Prof. Dr. Ir. Sebastian Margino

2008 | Tesis | S2 Bioteknologi

Beberapa genera bakteri, fungi, aktinomisetes dan khamir memiliki kemampuan dalam mendegradasi khitin dan juga perperan sebagai agensia pengendalian hayati terhadap fungi dan nematoda yang patogen. Telah diketahui bahwa Nematoda Sista Kuning/NSK (Globodera rostochiensis) merupakan hama baru yang menyebabkan kerusakan tanaman kentang di beberapa daerah di indonesia hingga 70% dan ditemukan pertama kali pada tahun 2003. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan isolasi dan seleksi bakteri khitinolitik, optimalisasi kondisi pertumbuhannya serta dilanjutkan dengan purifikasi dan karakterisasi enzim khitinase bakteri terpilih. Penelitian dilakukan secara bertahap, meliputi : (1) Isolasi dan seleksi bakteri khitinolitik; (2) Karakterisasi isolat unggul; (3) Optimalisasi kondisi pertumbuhan; (4) Purifikasi enzim dengan kromatografi penukar ion (DEAE cellulose) dan karakterisasi enzim khitinase dengan SDS-PAGE. Sebanyak 131 bakteri khitinolitik berhasil diisolasi dari limbah berkhitin, kompos dan dari rhizosfer tanaman Solanaceae. Dari 131 isolat, diperoleh 69 isolat dengan daya hidrolisis 2-3. Seleksi berdasarkan daya hidrolisis, aktivitas enzim spesifik dan bioassay terhadap telur NSK dilakukan terhadap 8 isolat terseleksi dengan daya hidrolisis ≥ 3. Salah satu dari 8 isolat (isolat D2) yang berasal dari rhizosfer tanaman kentang memiliki aktivitas terbaik dan dapat dimanfaatkan sebagai agensia pengendalian hayati Nematoda Sista Kuning (Globodera rostochiensis). Berdasarkan hasil karakterisasi sementara isolat D2 dikelompokkan sebagai Bacillus sp. Purifikasi khitinase Bacillus sp. D2 dengan kromatografi penukar ion (DEAE cellulose) meningkatkan aktivitas spesifik dan kemurnian enzim. Hasil karakterisasi enzim khitinase dengan SDS-PAGE diperoleh berat molekul khitinase Bacillus sp. D2 adalah 30 kDa. Analisis kinetika enzim menunjukkan nilai Km 2 mg/ml dan Vmaks 2, 2 μg/jam dengan aktivitas optimal khitinase pada suhu 300C dan pada pH 7.

Golden Cyst Nematodes (Globodera rostochiensis)/GCN found in Indonesia since 2003, researches estimated it’s cause 70% failure to growth and even damage of potato farming in several region in Indonesia. The aims of the research were to screened chitinolytic bacteria from rizosphere, chitinous wastes and compost, next optimization of the growth culture, purification and characterization of chitinases from primary selected isolate. The result of experiment find 131 isolates with hydrolytic activity in minimal medium contain 0,2% chitin colloidal. Among 131, there were 69 isolate with hydrolytic activity 2-3. Further screened, 8 isolates were selected for its high hydrolytic activity (≥3) and also high specific activity of chitinases. This results also correlated with bioassay using Globodera rostochiensis eggs treated for 3 days with crude enzyme and examine under stereo microscopes where the damage of 50%- 100% GCN egg walls begun with small scars in eggs surface to totally breakage of egg walls. On the last screened, one was chosen and called D2 bacteria. In further characterization, the primary select isolate were temporarily classify and named as Bacillus sp. D2. Optimal growth condition for Bacillus sp. D2 chitinase production were : 5% inoculum, 0,2% substrates, pH 6, agitation 150 rpm, and 72 hour for incubation time. Precipitation with 60% ammonium sulphates continued with Ion exchange chromatography (DEAE cellulose) increased specific activity and its purity. With SDS-PAGE 12,5% chitinase Bacillus sp. D2 had a Mr of 30 kDa. This chitinases optimally active at 300C, pH 7 and had the Km and Vmax towards colloidal chitin as a substrate was 2 mg/ml, and 2,2 μg/hr.

Kata Kunci : Bakteri khitinolitik,Pengendalian hayati NSK,Purifikasi khitinase,Chitinolytic bacteria,Biological Control of GCN,Purification of Chitinase