Subkloning dan over ekspresi gen penyandi protein GRA-1 Takizoit toxoplasma gondii isolat lokal

WIDAYANTI, Etty, Prof. Dr. drh. Wayan T. Artama

2008 | Tesis | S2 Bioteknologi

Protein GRA adalah komponen excreted/secreted antigens (ESA) yang bersifat imunodominan pada toksoplasmosis. Antigen GRA-1 (p24) merupakan protein yang diproduksi oleh takizoit dan bradizoit Toxoplasma gondii dan dapat digunakan sebagai kandidat vaksin karena memiliki kemampuan untuk menginduksi respon imun humoral dan seluler pada mencit dan manusia. Protein ini dapat diisolasi dari parasit tetapi untuk mendapatkan kuantitas yang mencukupi masih menghadapi banyak kendala. Kloning gen penyandi protein GRA-1 sudah berhasil dilakukan pada vektor kloning pGEM-T Easy tetapi subkloning pada vektor ekspresi pET-32a(+) belum dilakukan. Tujuan penelitian ini adalah untuk memproduksi protein GRA-1 melalui teknik rekombinan dengan melakukan ekspresi cDNA gen penyandi protein GRA-1 takizoit T. gondii isolat lokal. Complementary DNA gra-1 insert yang dipotong dari plasmid rekombinan pGEM-T Easy diligasikan ke vektor ekspresi pET-32a(+). Plasmid rekombinan ditransformasi ke E. coli BL21 dengan menggunakan metode heat shock dan ditumbuhkan pada media LB yang mengandung X-Gal, IPTG, dan ampisilin. Koloni rekombinan (berwarna putih) ditumbuhkan pada medium LB cair dan diinkubasi pada suhu 37oC semalam. Plasmid rekombinan diisolasi menggunakan metode alkali lisis dan dipotong dengan enzim Eco RI kemudian dielektroforesis menggunakan gel agarosa 1%. Ekspresi gen gra-1 diperoleh dengan cara menumbuhkan koloni yang membawa plasmid rekombinan pada media LB cair yang mengandung ampisilin dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 4 jam setelah pemberian IPTG. Protein rekombinan diperoleh dengan cara mengambil supernatan dari hasil sonikasi kemudian dianalisa dengan menggunakan SDS-PAGE dan imunobloting. Hasil penelitian menunjukkan bahwa transformasi plasmid rekombinan pada E. coli BL21 menghasilkan 30 koloni yang membawa gen penyandi protein GRA-1 dan gen tersebut telah berhasil diekspresikan. Produksi antibodi poliklonal anti ESA dan antibodi poliklonal anti GRA-1 untuk identifikasi protein juga telah berhasil dilakukan. Kesimpulan penelitian adalah gen penyandi protein GRA-1 T. gondii isolat lokal telah dapat disubkloning ke dalam vektor ekspresi pET-32a(+) dan protein rekombinan dengan berat molekul sekitar 24 kDa yang dihasilkan dapat diidentifikasi dengan antibodi poliklonal anti ESA dan antibodi poliklonal anti GRA-1.

Granule (GRA) proteins are components of immunodominant excreted/secreted antigens (ESA) with toxoplasmosis. The GRA-1 antigen (p24), a product of T. gondii tachyzoites and bradyzoites, is one of promising vaccine candidates. This antigen induces humoral and cellular immune responses in mice and humans. These proteins could be isolated from parasite but have problem in high quality. Cloning gene encoding GRA-1 protein into cloning vector of pGEM-T Easy has been succesfully done, however subcloning into expresssion vector of pET-32a(+) has not been done yet. The aim of this study is to produce GRA-1 protein through recombinant technique by expressing cDNA gra-1 of local isolated Toxoplasma gondii tachyzoite. Granule-1 (gra-1) cDNA insert digested from recombinant plasmid pGEM-T Easy is ligated into expression vector pET-32a(+). Recombinant plasmid is transformed into E. coli BL21 by heat shock method. The transformed E. coli BL21 is plated on LB containing X-Gal, IPTG, and ampicillin. Recombinant clones (white colony) are picked up and put into LB medium and incubated at 37oC overnight. Recombinant plasmids are isolated using alkali lysis method and confirmed by restriction analysis using restriction endonuclease Eco RI. Then recombinant clones are electrophorated on 1% agarose gel. Expression of gra-1 gene is obtained by growing into LB medium containing ampicillin and incubated at 37oC for 4 hours after adding IPTG. Recombinant protein is acquired by drawing supernatant from sonication product then analysed by SDS-PAGE and immunoblotting. The end of the study shows that transformation of recombinant plasmid into E. coli BL21 results in 30 colonies that bring gene coding GRA-1 protein and have been expressed succesfully. Production of anti ESA and anti GRA-1 polyclonal antibodies to identify protein has also been carried out. The conclusion of this study is that gene coding GRA-1 protein of local isolated T. gondii has been succesfully subcloned into expresssion vector pET-32a(+) and the recombinant protein which has molecular weight approximately 24 kDa could be identified by anti ESA and anti GRA-1 polyclonal antibodies.

Kata Kunci : Protein GRA,1,Subkloning,Over ekspresi,Toxoplasma,GRA-1 protein, subcloning, over expression, Toxoplasma gondii