Isolasi dan karakterisasi senyawa anti-Vibrio yang dihasilkan oleh isolat-isolat bakteri laut

ISTIQOMAH, Indah, Ir. Jaka Widada MP., Ph.D

2007 | Tesis | S2 Bioteknologi

Vibrio merupakan genus bakteri yang paling dominan menyerang komoditas perikanan laut. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi senyawa anti-Vibrio yang dihasilkan oleh isolat-isolat bakteri laut RLP1, S2V2, MIR2, MIR3, serta identifikasi bakteri terpilih penghasil senyawa anti-Vibrio. Empat isolat bakteri laut yang memiliki aktifitas anti-Vibrio diseleksi keragaman genetiknya menggunakan Rep-PCR. Seleksi selanjutnya didasarkan pada aktifitas dan spektrumnya terhadap bakteri Vibrio patogen menggunakan metode paperdisc diffusion pada double layer agar. Optimasi produksi senyawa anti-Vibrio dilakukan selama 168 jam. Isolasi senyawa anti- Vibrio dilakukan melalui fraksinasi bertingkat menggunakan partisi cair, kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Senyawa anti-Vibrio diidentifikasi menggunakan pereaksi penampak bercak, spektrum UV/VIS, spektrum IR, dan GC-MS. Pengujian aktifitas anti-Vibrio dilakukan secara in vitro. Identifikasi bakteri terpilih dilakukan secara morfologi, biokimia, fisiologi dan molekuler berdasarkan sekuen 16S rDNA. Seleksi berdasarkan keragaman genetik, aktifitas dan spektrum antagonisitas didapatkan dua isolat terpilih RLP1 dan S2V2. Fase pertumbuhan logaritmik kedua isolat terjadi pada 24 jam pertama. Senyawa anti-Vibrio mulai terdeteksi pada akhir fase logaritmik, dan produksi senyawa anti-Vibrio paling tinggi terjadi pada jam ke 72 oleh isolat RLP1 dan pada jam ke 96 oleh isolat S2V2. Fraksi aktif anti-Vibrio 1 (EK2) dan fraksi aktif anti-Vibrio 2 (EK 1-5-2) yang diproduksi oleh isolat RLP1 berhasil diisolasi. Fraksi aktif EK1-5-2 tidak menunjukkan reaksi positif terhadap pereaksi penampak bercak. Fraksi ini memiliki serapan pada spektrum UV sehingga diduga sebagai senyawa aromatis. Elusidasi berdasarkan IR menunjukkan adanya gugus –OH, C-N, C-H alifatis dan kemungkinan sebagai amina aromatis. Analisis GC-MS menunjukkan kemungkinan senyawa anti-Vibrio dalam fraksi aktif EK 1-5-2 sebagai 1H-indol- 2,3-dione (isatin). Fraksi aktif EK 1-5-2 bersifat bakterisidal pada dosis 3,2 mg/ml. Identifikasi bakteri laut penghasil senyawa anti-Vibrio RLP1 dan S2V2 menunjukkan kemiripan karakter tertinggi dengan P. flavipulchra dan P. citrea.

The members of the genus Vibrio are reported to be the most dominant bacteria causing severe damage to marine farmed fishes. The purpose of this research were to isolate and characterize anti-Vibrio substances produced by marine bacteria isolates, RLP1, S2V2, MIR2, MIR3, and to identify selected bacteria as source of anti-Vibrio substances. Antimicrobial activity and the host spectrum were evaluated by paper disc diffusion method on double layer agar. Genetic diversity of the isolates was analyzed using Rep-PCR. Growth of the bacteria in batch culture, and time course of its anti-Vibrio substances production were monitor during 168 hours. Anti-Vibrio substances were isolated by liquid partition, column chromatography and Thin Layer Chromatography. The isolated substances then elucidate by color reaction, UV/VIS spectra, IR spectra and GCMS analyses. In vitro antimicrobial activity (MIC and MBC) were evaluated. Anti-Vibrio substances producing bacteria were identified based on cell morphological, biochemical and physiological test and sequence of 16S rDNA. RLP1 and S2V2 isolates were selected based on its genetic diversity, antimicrobial activity and host spectrum. Exponential phase of their growth resulted up to 24 hours during fermentation. Anti-Vibrio substances were detected at the end of exponential phase, and maximum anti-Vibrio activity reached at 72 hours by RLP1 and 96 hours by S2V2. RLP1 isolate produced EK2 and EK 1-5-2 active fractions of anti-Vibrio. EK 1-5-2 did not respond to the color reaction. Optical density at UV spectra indicated that it was aromatic compound. IR spectra analysis indicated the present of functional groups (–OH, C-N, C-H aliphatic) and aromatic amines. GC-MS analysis indicated that anti-Vibrio substances of EK 1- 5-2 was 1H-indol-2,3-dione (isatin). Active fraction EK 1-5-2 show bactericidal effect at dose 3,2 mg/ml. Based on the all morphology, biochemical and physiological test and sequence of 16S rDNA, anti-Vibrio producing bacteria, RLP1 and S2V2 isolates were belong to Pseudoalteromonas and had highest character similarities with P. flavipulchra and P. citrea respectively. .

Kata Kunci : Senyawa Anti Vibrio,Isolat Bakteri Laut, anti-Vibrio, marine bacteria, Pseudoalteromonas, Rep-PCR, 16S rDNA, 1H-indol-2,3-dione (isatin), bactericidal