Karakterisasi gen sapi dan R522 serta produksi SAG1 rekombinan Toxoplasma gondii isolat lokal IS-1 sebagai dasar pengembangan diagnosa toksoplasmosis

HARTATI, Sri, Promotor Prof.drh. Hastari Wuryastuti, M.Sc.,Ph.D

2007 | Disertasi | S3 Ilmu Pertanian (Sain Veteriner)

Penelitian ini bertujuan untuk : 1. Isolasi dan karakterisasi gen penyandi Surface Antigen 1 (SAG1) Toxoplasma gondii isolat lokal IS-1 serta produksi SAG1 rekombinan dalam upaya pengembangan dia gnosa berdasarkan protein dan 2. Isolasi dan karakterisasi sekuen repetitif R522 untuk pengembangan metode diagnosa berdasarkan gen. Deoxyribonucleic acid diamplifikasi dengan PCR dan diklon dalam pCR2.1. Surface antigen1 kemudian diklon dalam vektor ekspresi prokariot pGEX- 2T. Protein SAG1 berfusi dengan GST diproduksi dalam E. coli BL21 dari konstruk pGEX-2T menggunakan kondisi optimal. Protein kemudian dip urifikasi dengan kromatografi afinitas Sekuensing nukleotida dilaksanakan untuk mengidentifikasi karakter gen. Perbandingan sekuen SAG1 dari 8 strain atau isolat T. gondii, termasuk IS-1, menunjukkan adanya konservasi tinggi. Sekuen-sekuen tersebut terbagi dalam dua kelompok utama dan tidak tergantung asal geografinya. Cabang filogenetik menunjukkan bahwa sekuen tersebut dapat dipergunakan untuk menentukan strain dan IS-1 termasuk strain RH yang virulen. Protein rekombinan SAG1 berfusi dengan GST (56 kDa) berhasil diproduksi dalam E. coli BL21. Perbandingan sekuen R522 IS-1 dengan dua sekuen R522 lainnya menunjukkan bahwa R522 lebih mudah bervariasi. Berkat jumlah copynya yang tinggi didalam genom parasit (200-300), R522 merupakan target yang menjanjikan untuk pengembangan metode diagnosa berdasarkan asam nukleat.

The present research was carried out : 1. To isolate and characterize the Surface Antigen 1 (SAG1) gene of the Indonesian Toxoplasma gondii isolate IS -1 and to produce recombinant SAG1 for the development of protein-based diagnostic tools and 2. To isolate and characterize the repeat sequence R522 for the development of gene-based detection methods. Deoxyribonucleic acid was amplified by PCR and cloned in pCR2.1. SAG1 gene was further cloned in the bacterial expression vector pGEX-2T. Recombinant protein SAG1 fused to GST was produced in E. coli BL21 from pGEX-2T construct using the optimal conditions. It was further purified by affinity chromatography. Nucleotide sequencing was performed to identify the gene characteristics. Sequence comparison of SAG1 from 8 strains or isolates of T. gondii, including IS-1, indicated a high degree of conservation. Sequences were divided into two major families, independently of their geographical origin. Their phylogenetic tree showed that they can be used in strain determination and that IS -1 belonged to the virulent RH strain. Recombinant SAG1 fused to GST (56 kDa) was produced in E. coli BL21. The comparison of the established IS-1 R522 sequence with two other R522 sequences showed that R522 is more prone to variations. Due to its high copy number in the parasite genome (200-300), R522 is a promising target for use in nucleic acid-based diagnostic tools.

Kata Kunci : Toxoplasma Gondii,Isolasi Gen SAG1,DNA Rekombinan,R522, Toxoplasma gondii, tachyzoite, SAG1, recombinant DNA, R522