Fungsi ganda Green Fluorescent Protein (GFP) pada sistem transformasi gen dengan mediator Agrobacterium pada tanaman anggrek Phalaenopsis amabilis (L.) BI :: Sebagai gen pelapor dan penambah estetika tanaman

MARTIWI, Ika Nugraheni Ari, Dr. Endang Semiarti, MS.,M.Sc

2007 | Tesis | S2 Biologi

Tanaman anggrek alam Phalaenopsis amabilis sangat potensial sebagai induk silangan dalam pembuatan anggrek Phalaenopsis hibrida yang bernilai ekonomi tinggi. Untuk meningkatkan nilai estetika tanaman anggrek tersebut telah dikembangkan metode transformasi gen dengan gen Green Fluorescent Protein (GFP) untuk memodifikasi P. amabilis secara genetik menjadi tanaman berfluoresen. Selain itu penggunaan GFP sebagai gen pelapor dapat mempercepat proses seleksi tanaman transforman. Transformasi dilakukan dengan menggunakan Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 yang membawa vektor pBI121 dengan T-DNA pembawa gen resisten terhadap kanamisin dan gen GFP dikontrol dengan promoter konstitutif 35S. Inokulum transformasi ditumbuhkan pada medium New Phalaenopsis (NP) yang ditambah substansi organik ekstrak tomat 100 gram/liter dan air kelapa 15% selama 3 minggu. Inokulum ditumbuhkan pada medium induksi kalus selama 1 minggu, kemudian dikokultivasi dengan kultur A. tumefaciens pada variasi perbandingan medium 1/2 NP cair : kultur A. tumefaciens: 0:1; 1:1; 2:1; 3:1; dan 4:1 selama 30 menit, kemudian dikokultivasi pada medium induksi kalus selama 1 minggu. Selanjutnya kultur ditransfer pada medium induksi tunas NP+2 isopenthenyladenine (2-iP) 5μM + Naphtalene acetic acid (NAA) 0,15 μM dengan penambahan antibiotik karbenicilin 50 mg/l. Setelah dicuci dengan larutan antibiotik kanamisin 200 mg/l dan karbenisilin 200 mg/l, kultur ditransfer ke medium induksi tunas. Medium diperbaharui setiap minggu sampai diperoleh kandidat tanaman transforman yang kemudian tumbuh membentuk tunas. Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode transformasi dengan rasio medium cair 1/2 NP: A. tumefaciens =4:1 yang membawa konstruksi 35S::GFP telah berhasil diperoleh transforman dengan efisiensi 13,48%, dan perlakuan transformasi dengan vektor pBI 35S menghasilkan 16,67%. Transforman menunjukkan morfologi normal. Seleksi transforman dilakukan dengan deteksi fluorisensi warna hijau dengan cahaya biru dari dark Reader pada protokorm umur 15 minggu, sedangkan non transforman menunjukkan warna merah autofluoresen. Analisis molekular keberadaan fragmen GFP pada genom transforman dilakukan dengan polymerase chain reaction (PCR). GFP dapat digunakan sebagai gen pelapor dan penambah nilai estetika tanaman dalam sistem transformasi gen dengan mediator Agrobacterium pada tanaman anggrek P. amabilis.

Phalaenopsis amabilis, is a wild orchid of Indonesia, which have been potential as parental to create hybrid-orchid with high economical value. To improve it’s aesthetical value, this species can be modified through genetic transformation method using GFP gene to yield fluorescent plant. GFP can also function as a reporter gene to accelerate the selection of transgenic plant. Transformation of GFP have been done, mediated by Agrobacterium tumefaciens LBA4404 which harbour pBI121 vector with T-DNA that construct resistence gene to kanamycin, and GFP gene that controlled by 35S constitutive promoter. Inocula for transformation were obtained by germinated seed of P. amabilis on New Phalenopsis (NP) medium, that have been added with tomato extract 100 gr/l and coconut water 15%, 3 weeks of ages. Inoculum was cultured on callus induction medium for a week, then cocultivied in ratio of 0:1; 1:1; 2:1; 3:1 and 4:1 of liquid ½ NP medium and A. tumefaciens culture for 30 minutes. After cocultivation, inocula were cultured on callus induction medium for 1 week, then overplanted into shoot induction medium NP+ 2 isopenthenyladenine (2-iP) 5μM + Naphtalene aceticacid (NAA) 0,15 μM with added 50 mg/l carbenicilin. After 1 week on this medium, culture were rinsed using liquid NP medium containing 200 mg/l kanamycin and 200 mg/l carbenicilin, then trans ferred into shoot induction medium containing kanamycin as the selective agents. The culture medium was renewed each week until yielding putative transgenic plants. The result showed that transformation method using ratio of liquid ½ NP medium and A. tumefaciens culture = 4:1 yielded transformant plant with the highest efficiency, 13.48 % for 35S::GFP construct and 16.67 % for pBI 35S vector. The transformants were morphologically normal. Selection of the tranformant was done in 15 week old protocorm using blue light from dark reader. A positive were indicated through green fluorescence and red autofluorescence indicates negative result. The GFP fragments in the plants genome were detected by PCR analysis. The result indicate that GFP can be used easily as a reporter gene in Agrobacterium-mediated transformation system in P. amabilis orchid plants.

Kata Kunci : Tanaman Anggrek P Amabilis,Transformasi Genetik GFP, Phalaenopsis amabilis, transformation, Agrobacterium tumefaciens, 35S, GFP