Kloning gen penyandi protein Gra1 takisoit Toxoplasma gondii isolat lokal

BAGASKORO, Fredeswinda, Dr.drh. Wayan Tunas Artama

2006 | Tesis | S2 Ilmu Kedokteran Tropis

Protein granula 1 (GRA1) takisoit Toxoplasma gondii isolat lokal merupakan salah satu protein yang disekresi pada saat T. gondii masuk ke dalam tubuh hospes. Protein ini disekresi ke dalam vakuola parasitoporus terutama pada saat parasit sudah masuk ke dalam sel serta memiliki kemampuan mengikat ion kalsium (Ca2+). Gen penyandi protein GRA1 ini dikloning agar protein yang diekspresikan dapat sebagai kandidat diagnostik maupun vaksin yang baik. Penelitian bertujuan untuk mengkloning gen penyandi protein GRA1 dan mengetahui homologinya dengan isolat RH. Isolasi DNA (Deoxyribonucleic Acid) dari takisoit Toxoplasma gondii isolat lokal dilakukan dengan memperbanyak takisoit secara in vivo pada mencit strain BALB/C. Isolasi DNA yang dilakukan kemudian diamplifikasi menggunakan kit PCR Beads Ready To Go (Amersham). Hasil amplifikasi diligasi ke dalam plasmid menggunakan pGEM-T Easy Vector System (Promega). Hasil ligasi ditransformasikan ke dalam bakteri Escherichia coli strain XL-1 Blue menggunakan metode elektroporasi. Transforman ditumbuhkan ke dalam cawan agar yang sudah berisi Ampisilin, X-Gal dan IPTG selama semalam pada suhu 37oC. Koloni putih yang menunjukkan E. coli yang mengandung plasmid rekombinan ditumbuhkan pada suhu 37oC di medium yang sudah diberi ampisilin. Plasmid rekombinan diisolasi menggunakan metode lisis alkali dan dielektroforesis pada gel agarose 1,5% (Gibco). Analisa plasmid rekombinan dilakukan dengan digesti menggunakan enzim endonuklease restriksi Eco RI dan selanjutnya disekuen untuk mengetahui urutan basanya. Primer spesifik GRA1 telah mengamplifikasi gen sepanjang 827 bp. Sekuensing menunjukkan bahwa genome yang berhasil dikloning sebesar 827 bp dan menunjukkan kesamaan urutan basa dengan gen penyandi protein GRA1 isolat RH sebesar 100 persen.

Granule 1 protein (GRA1) of tachyzoite of Toxoplasma gondii local isolate is one of protein that secreted when T. gondii entered hospes. This protein is secreted into the parasitophorus vacuole especially when parasite has entered the cell. Gene encoding protein GRA1 was cloned to make secreted protein become vaccine and diagnostic tools. The aim of this study is to clone the gene encoding dense granule protein GRA1 and to study its similarities with RH isolate. Deoxyribonucleic Acid (DNA) was isolated from tachyzoite of Toxoplasma gondii local isolate and cultured in vivo in BALB/C strain mice. Isolated DNA was added in the prepared tube then amplified using PCR Beads. The result of amplification was ligated into the plasmid using pGEM-T Easy Vector System (Promega). The result of ligation was transformed into Escherichia coli XL-1 Blue strain using electroporation method. Transforman was cultured in medium plate contained Ampicillin, X-Gal and IPTG over night in 37oC temperature. White colonies indicate E. coli that contained recombinant plasmid grown in 37oC medium containing ampicillin. Recombinant plasmid was isolated using Alkali Lysis method and electrophorated in gel agarose 1,5% (Gibco). Plasmid recombinant analyzed using restriction enzyme Eco RI and sequenced to get information on DNA base. Specific primer encoding for GRA1 gene has amplify the gene with the size of 827 bp. Sequence result shows that the genome with the size of 827 bp has been cloned successfully and homology with RH isolate is 100%.

Kata Kunci : Toxoplasma gondii,Protein Granula I,Kloning Gen, Dense Granule protein, Toxoplasma gondii, tachyzoite, Recombinant Plasmid