Kloning cDNA penyandi protein GRA1 Takizoit Toxoplasma gondii isolat lokal

SULISTYANINGSIH, Erma, Dr.drh. Wayan T. Artama

2006 | Tesis | S2 Bioteknologi

Toxoplasma gondii adalah parasit obligat intraseluler yang menginvasi vertebrata berdarah panas dan merupakan patogen oportunistik pada manusia. Prevalensinya cukup tinggi dan tersebar di seluruh dunia. Salah satu protein yang berperan penting dalam proses infeksi dan menimbulkan respon imun adalah protein GRA1. Protein rekombinan GRA1 telah diteliti dan digunakan untuk mendeteksi Ig M dan Ig G spesifik T. gondii. Gen penyandi protein GRA1 merupakan kandidat vaksin yang potensial dalam mengatasi toksoplasmosis. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan klon pembawa gen penyandi protein GRA1 takizoit T. gondii isolat lokal melalui teknologi DNA rekombinan. Kultivasi takizoit T. gondii dilakukan secara in vivo pada mencit strain Balb/c. Dilakukan beberapa kali pasase sampai diperoleh jumlah takizoit yang cukup (1x109 takizoit/ml), untuk isolasi RNA total menggunakan RNAgents Total RNA Isolation System (Promega). Messenger RNA diisolasi dari RNA total menggunakan PolyATract mRNA Isolation System (Promega) yang selanjutnya digunakan untuk mensintesis cDNA menggunakan Universal Riboclone cDNA Synthesis System (Promega). Complementary DNA yang didapat diamplifikasi menggunakan Pure Taq RTG-PCR Beads (Amersham Bioscience) dengan primer spesifik (Cybergene AB) dan produknya diligasi dengan pGEM-T Easy Vector (Promega). Hasil ligasi ditransformasi ke dalam E. coli XL-1 Blue dengan metode heat shock, transforman ditanam pada plate agar LB yang mengandung ampicilin, IPTG dan X-gal kemudian diinkubasi pada suhu 37oC semalam. Koloni putih yang menunjukkan koloni rekombinan ditumbuhkan pada media LB yang mengandung ampicilin dan diinkubasi pada suhu 37oC dengan agitasi 200 ppm semalam. Plasmid DNA rekombinan diisolasi dengan metode lisis alkali dan dielektroforesis dengan gel agarose 1% (SeaKem). Analisis plasmid rekombinan dilakukan dengan digesti enzim endonuklease restriksi EcoRI (Fermentas) dan selanjutnya urutan basa disequensing dengan ABI PRISM 3130 Genetic Analyser. Hasil penelitian menunjukkan bahwa transformasi pada E. coli XL1-Blue dengan vektor pGEM-T Easy diperoleh klon yang membawa gen penyandi protein GRA1 Toxoplasma gondii isolat lokal sebesar 692 bp. Alignment sequen DNA rekombinan menunjukkan homologi dengan gen penyandi protein GRA1 Toxoplasma gondii isolat RH sebesar 100%.

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that infects most of warm-blooded vertebrata and important opportunistic pathogen in human. Prevalence of toxoplasmosis is high and spreads all over the world. One of the proteins which plays an important role in the invasion process and elicits immune response is GRA1 protein. GRA1 recombinant protein has been investigated and used to detect T. gondii-specific Ig M and Ig G. Gene encoding GRA1 protein is potent DNA-vaccine candidate against toxoplasmosis. The aim of the research was to clone the gene encoding GRA1 protein of tachyzoite Toxoplasma gondii local isolate by DNA recombinant technology. Tachyzoite was grown in Balb/c mice in vivo. In order to get enough tachyzoite (1x109) many passage were done. Total RNA was isolated using RNAgents Total RNA Isolation System (Promega). Messenger RNA was isolated from total RNA using PolyATract mRNA Isolation System (Promega) and it was used to synthesis cDNA using Universal Riboclone cDNA Synthesis System (Promega). Complementary DNA was amplified using PuRe Taq RTG-PCR Beads (Amersham Bioscience) with specific primers (Cybergene AB). The amplified DNA fragment was ligated into pGEM-T Easy (Promega) and transformed into E. coli XL-1 Blue by heat shock method. The transformed E. coli plated on LB agar containing ampicillin, IPTG and X-gal and incubated at 37oC overnight. White colonies (recombinant colonies) were picked up and put in LB medium containing ampicillin and incubated at 37oC overnight. Recombinant plasmids were isolated using alkali lysis method and electroforated on a 1% agarose gel (SeaKem). Analysis of recombinant plasmids were done by digesting restriction endonuclease EcoRI and sequencing by ABI PRISM 3130 Genetic Analyser. The result showed that transformation in E. coli XL-1 Blue by pGEM-T Easy produced a clone of gene encoding GRA1 protein of Toxoplasma gondii local isolate. Alignment of recombinant DNA sequence to gene encoding GRA1 protein of T. gondii RH isolate showed 100% homology.

Kata Kunci : Kloning cDNA,Protein GRA1,Toxoplasma gondii, GRA1 protein, Toxoplasma gondii, tachyzoite, cloning, complementary DNA