Peranan Kosubstrat dalam metabolisme Xilosa dan produksi Xilitol oleh Candida shehatae Way 08

YULIANTO, Wisnu Adi, Promotor Prof.Dr.Ir. Kapti Rahayu Kuswanto

2006 | Disertasi | S3 Ilmu Pertanian (Ilmu Pangan)

Produksi xilitol dari xilosa secara fermentasi oleh khamir alami memiliki kelemahan rendemen xilitol- xilosa yang dihasilkan rendah. Peningkatan rendemen xilitol- xilosa tersebut dapat dilakukan dengan penambahan kosubstrat. Tujuan umum penelitian ini ialah mengungkap peranan kosubstrat dalam metabolisme xilosa dan pembentukan xilitol oleh Candida shehatae WAY 08. Secara khusus penelitian ini bertujuan: 1) mengetahui kadar xilosa yang optimal untuk produksi xilitol oleh C. shehatae WAY 08, 2) mengetahui jenis kosubstrat dan nisbah substrat (xilosa) dengan kosubstrat yang optimal untuk produksi xilitol, 3) mengetahui afinitas xilosa reduktase (Km) terhadap NADPH dan NADH, dan 4) mengetahui dan mengevalusi kinetika fermentasi dan aktivitas enzim-enzim utama yang berperan dalam metabolisme xilosa dan pembentukan xilitol selama fermentasi xilosa + kosubstrat, yaitu xilosa reduktase (XR), xilitol dehidrogenase (XDH), glukosa 6 fosfat dehidrogenase (G6DH), alkohol dehidrogenase (ADH) dan asetaldehida dehidrogenase (AsDH). Tahapan penelitian yang dilakukan mencakup penentuan kadar xilosa awal sebesar 20, 60, 100, dan 140 g/l, penambahan kosubstrat yang berupa D-galaktosa, D-glukosa, D-manosa dan L-arabinosa dan nisbah xilosa (substrat) dengan kosubstrat sebesar 60:0, 60:10, 60:20, dan 60:30 g/l dan penentuan afinitas xilosa reduktase (Km) terhadap NADPH dan NADH. Penelitian berikutnya mengkaji kinetika fermentasi dan aktivitas enzim- enzim utama dari hasil penelitian sebelumnya. Parameter kinetika fermentasi yang diamati meliputi kadar: biomassa, xilosa, kosubstrat, xilitol, etanol dan asam asetat; rendemen xilitol- xilosa (Y p/s); rendemen biomassa-gula (Yx/s); laju produksi xilitol volumetrik (Qv) dan rendemen etanol- gula (Y e/s). Aktivitas enzim yang ditentukan meliputi XR, XDH, 6PDH, ADH, dan AsDH . Aktivitas enzim diukur dengan memantau oksidasi atau reduksi koenzim NADPH/NADP+ secara spektrofotometrik pada panjang gelombang 340 nm. Analisis yang dilakukan meliputi berat kering sel (biomassa) diukur denga n metode gravimetri dan penentuan kadar xilosa, xilitol, kosubstrat, etanol, dan asetat menggunakan HPLC. Candida shehatae WAY 08 yang ditumbuhkan pada xilosa awal 60 g/l dapat menghasilkan Y p/s sebesar 0,63 g/g dan Qv sebesar 0,73 g/l jam. Penambahan kosubstrat dengan nisbah kosubstrat arabinosa (pentosa) dengan xilosa 10:60 – 30:60 g/l dapat meningkatkan Y p/s, sedangkan penambahan kosubstrat galaktosa, glukosa dan manosa (heksosa) menurunkan produksi xilitol, tetapi mendorong pembentukan biomassa dan etanol. Rendemen biomassa- gula tertinggi dicapai pada substrat heksosa yang besarnya 0,20-0,21 g/g dan Y e/s tertinggi (0,36 g/g) pada substrat galaktosa. Xilosa reduktase lebih bergantung pada NADPH (Km lebih kecil) dibanding dengan NADH. Penambahan kosubstrat glukosa, galaktosa, dan manosa merepresi aktivitas XR dan G6PDH, serta cenderung merepresi XDH dan AsDH, tetapi menginduksi aktivitas ADH. Penambahan kosubstrat arabinosa 10 – 20 g/l pada substrat xilosa 60 g/l dapat menginduksi XR dan G6PDH, dan sedikit merepresi XDH sehingga menghasilkan Y p/s 0,85-0,91 g/g, Qv 0,66 – 0,65 g/l jam, dan Y p/x 5,90-6,45 g/g. Nisbah aktivitas XR:XDH:G6PDH pada kondisi tersebut sebesar 5:1: (15-16).

Higher xylitol yields may be difficult to obtain with natural xylose-fermenting yeasts, since a fraction of the produced xylitol is further metabolized to yield cell mass, maintenance energy, and reducing power. Xylitol yield can be increased by cosubstrate addition. The general purpose of the research, entitled “The Role of Cosubstrate in Xylose Metabolism and Xylitol Production by Candida shehatae WAY 08” is to disclose the role of cosubstrate in xylose metabolism and xylitol production by Candida shehatae WAY 08. Specifically, the research is aimed at: 1) determining optimal xylose concentration to produce xylitol by Candida shehatae WAY 08, 2) determining cosubstrate type and optimal ratio of substrate (xylose) to cosubstrate to produce xylitol, 3) determining affinity of xylose reductase (Km) to NADPH and NADH, and 4) determining and evaluating fermentation kinetic and main enzymes activity that take part in xylose metabolism and xylitol production during xylose + cosubstrate fermentation, i.e. xylose reductase (XR), xylitol dehydrogenase (XDH), glucose 6 phosphate dehydrogenase (G6PDH), alcohol dehydrogenase (ADH) and acetaldehyde dehydrogenase (AsDH). The research phases including determining initial xylose concentration amounted to 20, 60, 100, and 140 g/l, adding cosubstrate ,i.e. D-galactose, D-glucose, D-mannose, and Larabinose and ratio of xylose (substrate) to cosubstrate as follows 60:0, 60:10, 60:20, and 60:30 g/l and determining affinity of xylose reductase (Km ) with NADPH and NADH. Further research studied fermentation kinetic and main enzymes activity resulted from the former research. Parameter of kinetics of fermentation which was observed consists of biomass, xylose, xylitol, ethanol, acetic acid, product (xylitol) yield (Y p/s), growth yield (Y x/s), volumetric xylitol production rate (Qv), and ethanol yield (Y e/s). Enzyme activity which were determined consists of XR, XDH, G6PDH, ADH, and AsDH. The enzyme activities were determined spectrophotometrically at 340 nm. Biomass concentration was determined by gravimetri method. Xylose, xylitol, cosubstrate, ethanol and acetic acid concentrations were determined using HPLC The result indicated that with the medium containing 60 g/l xylose produced the Y p/s 0.63 g/g and Qv was 0.73 g/l h. Cosubstrate addition with the 10:60 – 30:60 g/l ratio of arabinose (pentose) to xylose (substrate) could increase Y p/s, while galactose, glucose, and mannose (hexose) cosubstrate addition reduced xylitol production, but stimulated ethanol and biomass formation. The highest Y x/s was achieved on hexose substrate amounted to 0.20 – 0.21 g/g and the highest Y e/s (0.36 g/g) on galactose substrate. Xylose reductase depended to NADPH (smaller Km) more than to NADH. Glucose, galactose, and mannose cosubstrate addition repressed XR and G6PDH activities, and tended to repress XDH and AsDH, but induced ADH activity. Addition of 10-20 g/l arabinose to 60 g/l xylose induced XR and G6PDH and repressed XDH a bit so that resulted in the Y p/s 0.85– 0.91 g/g, Qv 0.65– 0.66 g/l h, and Y p/x 5.90-6.45 g/g. Activity ratio of XR:XDH:G6PDH on 60:10 – 60:20 (g/l) xylose:arabinose ratio was 5:1: (15–16).

Kata Kunci : Xilosa,Xilitol, Candida Shehatae WAY 08, Xylose, cosubstrate, xylitol, Candida shehatae WAY 08, xylose reductase, xylitol dehydrogenase, glucose 6 phosphate dehydrogenase