Peran jamur Aspergillus proteolitik yang bersifat non-aflatoksigenik dari koji dalam bioreduksi aflatoksin B1

SARDJONO, Promotor Prof.Dr.Ir. Kapti Rahayu

2006 | Disertasi | S3 Ilmu Pertanian (Ilmu Pangan)

Aflatoksin B1 telah diketahui merupakan mikotoksin pencemar terbesar pada bijibijian dan kacang-kacangan di Indonesia. Aflatoksin B1 dikenal sebagai jenis mikotoksin yang paling berbahaya dan memiliki sifat yang stabil terhadap faktor pengolahan pada umumnya. Salah satu industri pengolahan yang menggunakan bijian sebagai bahan mentahnya adalah industri pembuatan kecap. Hasil survey terdahulu diketahui bahwa 9,31% kecap komersial yang beredar dipasar telah tercemar aflatoksin B1 dengan konsentrasi lebih dari 11 ppb. Namun demikian ada beberapa pabrik yang dapat menghasilkan kecap bebas aflatoksin B1, walaupun diketahui bahan mentahnya sudah tercemar aflatoksin B1 dan jamur penghasil aflatoksin juga terlibat dalam fermentasi liar selama proses fermentasi koji. Dari survey diketahui bahwa selama proses fermentasi koji di beberapa pabrik tersebut terdapat jamur Aspergillus oryzae dengan populasiantara 30% sampai dengan 100% dan jamur tersebut tidak dijumpai pada pabrik-pabrik lainya. Diduga selama proses fermentasi tersebut, terdapat kelompok Aspergillus oryzae yang mampu berperan dalam melakukan biodegradasi aflatoksin B1. Jamur Aspergillus yang memiliki sifat proteolitik yang baik sangat diperlukan pada fermentasi koji, karena diperlukan untuk memecah senyawa protein menjadi peptida sederhana dan asam amino yang berperan pada pembentukan kualitas kecap yang dihasilkan. Oleh karenanya sangat penting untuk dapat mengisolasi jamur Aspergillus yang memiliki ketiga sifat tersebut : (1) aktivitas proteolitik yang tinggi (2) tidak berpotensi menghasilkan aflatoksin (3) dapat mereduksi aflatoksin. Hal ini disebabkan karena jamur tersebut dapat dikembangkan menjadi inokulum kecap yang dapat menjamin produk akhirnya bebas dari cemaran aflatoksin, atau digunakan untuk tujuan detoksifikasi B1 pada proses pengolahan pangan lainnya. Beberapa penelitian menyebutkan jamur Rhizopus oligosporus dan Neurospora crassa dapat menurunkan cemaran aflatoksin dan merubah aflatoksin B1 menjadi bersifat lebih polar, dapat menghasilkan aflatoksikol, tetapi mekanismenya belum diungkap, sehingga pengembangan lebih lanjut dalam aplikasinya tidak dapat diformulasikan dengan baik. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi jamur Aspergillus yang memiliki ensim proteolitik, tidak menghasilkan aflatoksin dan mampu melakukan bioreduksi aflatoksin B1. Melakukan penelusuran peran jamur tersebut dalam melakukan bioreduksi aflatoksin B1 untuk mngetahui mekanisme bioreduksinya serta mengevaluasi apakah jamur tersebut dapat melakukan detoksifikasi aflatoksin B1. Pada penelitian ini digunakan medium Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol (DRBC) untuk isolasi, medium Aspergullius flavus / parasiticus agar (AFPA) untuk seleksi jamur non-aflatoksigenik serta medium susu skim untuk uji proteolitik. Identifikasi dilakukan sampai tingkat spesies dan kemudian diuji kemampuan degradasinya terhadap aflatoksin B1. Isolat yang memiliki kemampuan bioreduksi yang paling tinggi dipilih untuk digunakan dalam penelusuran mekanisme bioreduksi aflatoksin B1. Penelusuran dilakukan terhadap kemungkinan aflatoksin B1 terikat pada miselia, direduksi oleh enzim ekstraseluler atau direduksi oleh enzim intraseluler. Uji toksisitas hasil bioreduksi dilakukan dengan menggunakan Bacillus megaterium sebagai bakteri uji. Dari enambelas isolat Aspergillus yang memiliki sifat proteolitik, sebelas diantaranya ternyata berpotensi membentuk aflatoksin. Dari lima isolat yang tidak berpotensi menghasilkan aflatoksin, satu isolat diidentifikasi sebagai Aspergillus flavus ,satu isolat Aspergillus parasiticus dan tiga isolat sebagai Aspergillus oryzae. Kelima isolat jamur tersebut diuji kemampuan bioreduksinya terhadap aflatoksin B1 pada medium Glucose Ammonium Nitrate (GAN). Dari hasil penelitian diketahui kelima isolat jamur tersebut mampu menurunkan kadar aflatoksin B1 pada medium dan menghasilkan beberapa noda baru pada lempeng TLC. Berdasarkan pada nilai Retension factor (Rf) nya, noda-noda tersebut bersifat lebih polar dibandingkan dengan aflatoksin B1. Di antara kelima isolat tersebut, A. oryzae KKB4 memiliki kemampuan melakukan bioreduksi aflatoksin B1 yang paling besar, sehingga digunakan lebih lanjut untuk melakukan penelusuran perannya dalam bioreduksi aflatoksin B1. Diketahui bahwa biomassa miselia jamur A. oryzae KKB4 yang terbentuk pada medium yang dicemari aflatoksin B1 lebih sedikit bila dibandingkan dengan biomassa miselia jamur yang terbentuk pada medium tanpa aflatoksin B1 . Penurunan aflatoksin B1 dalam medium dipengaruhi oleh banyaknya biomassa miselia , yakni makin banyak pertumbuhan biomasa miselia jamur, penurunan konsentrasi aflatoksin B1 juga lebih besar. Mekanisme bioreduksi aflatoksin B1 oleh jamur tersebut adalah dengan pengikatan aflatoksin B1 pada miselia jamur, serta oleh enzim ekstraseluler yang dihasilkan oleh A. oryzae KKB4. Keduanya berjalan secara paralel. Dari hasil filtrasi gel, diketahui ada lima fraksi enzim ekstraseluler. Fraksi A memiliki kemampuan bioreduksi yang paling besar, yakni 0,37 ng aflatoksin B1 / mg protein enzim/ jam. Analasis HPLC menunjukkan puncak kromatogram hasil bioreduksinya masih dekat dengan puncak khromatogram aflatoksin B1 standar. Kemungkinan terjadi perubahan-perubahan pada beberapa gugus fungsional molekul aflatoksin B1. Hasil bioreduksi aflatoksin B1 fraksi tersebut tidak bersifat toksis pada uji toksisitas, sehingga disimpulkan A. oryzae KKB4 mampu melakukan detoksifikasi aflatoksin B1 oleh enzim ekstraseluler yang dihasilkan.Tidak seperti halnya enzim ekstraseluler, ensim intraseluler sangat kecil perannya dalam bioreduksi aflatoksin B1 oleh A. oryzae KKB4. Berdasarkan pada spektra infra merah, proses bioreduksi tersebut menyebabkan hilangnya gugus fungsional C=O, C=C dan C-O-C epoksi serta gugus difuran dari molekul aflatoksin B1. Perubahan yang terjadi pada gugus fungsional tersebut memberikan kontribusi pada hilangnya sifat toksis hasil bioreduksi oleh enzim ekstraseluler tersebut. Selain berubahnya gugus difuran, kemungkinan molekul aflatoksin B1 juga mengalami perubahan pada gugus siklopentanon dan hirolisa pada gugus lakton. Reduksi siklopentanon nampaknya menyebabkan hasil bioreduksinya bersifat lebih polar.

Aflatoxin B1 is the most harmful mycotoxin to human health, it is well known as the highest mycotoxins contaminant in Indonesian grain and nuts. Because of their stability against ordinary processing factors, several food products are known contaminated by aflatoxin B1. Indonesian soy sauce (kecap) is a kind of fermented product, produce from soybean or other protein rich grain, through two stage of fermentation. The first fermentation is mold fermentation (called “koji” fermentation) and second is brine fermentation. Previous study indicated that 9.31% commercial kecap were contaminated by aflatoxin B1 more than 11 ppb. It was observed that contamination of aflatoxin in kecap because of aflatoxin B1 contamination in raw materials and involvement of aflatoxin producing mold during koji fermentation. However when Aspergillus oryzae were found during koji fermentation, the product was safe from aflatoxin, although the raw material was contaminated by aflatoxin B1 and aflatoxin producing molds were involved during koji fermentation. It might be because of the existence of Aspergillus oryzae, one of species of proteolytic Aspergillus during koji fermentation able to suppress the production of aflatoxin B1 and able to degrade aflatoxin B1 during its growth. Isolation and characterization of proteolytic Aspergillus from koji and evaluation their role on degradation of aflatoxin B1 is very important in order to develop those molds in eliminating of aflatoxin B1 during food processing. Research on the mechanism of bioreduction of aflatoxin B1 is important for further application of the mold in food industry. It was known that Rhizopus oligosporus and Neurospora crassa able to degrade aflatoxin, but the mechanisms still not clear. It was reported that they able to convert the aflatoxin B1 into more polar compound, to convert the aflatoxin B1 into aflatoxicol. Several research reported the role of Lactic Acid Bacteria on degradation of aflatoxin, but there was no information on the mechanism of mold degradation of aflatoxin. The object of this research were to isolate the “non-aflatoxigenic” and proteolytic Aspergillus from koji, evaluate their capability on reducing aflatoxin B1 , identify its role on bioreduction the aflatoxin, to know the toxicity of bioreduction products, and to observe the change of functional group of aflatoxin B1 after bioreduction. Isolation was carried out in Dichloran Rose Bangal Chloramphenicol (DRBC) medium, their non-aflatoxigenic characteristic was evaluated on Aspergillus flavus/parasiticus Agar (AFPA) medium and the proteolytic activity was observed in skim milk agar medium. Identification was done up to species level. The capability of isolate on bioreduction of the aflatoxin was carried out in Glucose Ammonium Nitrate (GAN) medium using submerged culture system. Isolate with the highest potential on bioreduction was chosen for evaluation of its role on bioreduction of aflatoxin B1. Mechanism of bioreduction was done on the possibility of binding the aflatoxin B1 on mycelium, the ability of extracellular enzyme to reduce the aflatoxin and the ability of intracellular enzyme on bioreduction of the aflatoxin B1. Bacillus megaterium was used as indicator microorganism for toxicity test and Infra Red Spectrometric was used for evaluation the differences of functional group between the aflatoxin B1 and bioreduction products. Among sixteen isolates of proteolytic Aspergillus, eleven isolates were aflatoxigenic. According to the identification results, from five isolates of noaflatoxigenic isolates, one isolate belong to Aspergillus flavus, one belong to A. parasiticus and the three isolates belong to Aspergillus oryzae. All of five isolates were tested for their ability on reducing the aflatoxin and they showed different capability in reducing aflatoxin. It was found several fluorescent spots on TLC plate were produced by bioreduction products, closed to the aflatoxin B1 spot. Aspergillus oryzae KKB4 showed the highest potential for bioreduction of the aflatoxin B1 and it was further used for evaluation of its role on bioreducton of the aflatoxin B1. The growth of Aspergillus oryzae KKB4 in the Glucose Ammonium Nitrate medium contaminated by aflatoxin B1 was lower than the growth on the medium without aflatoxin B1. Decreasing of aflatoxin B1 concentration in medium affected the increasing of mycelium biomass. It was found that the mechanisms of aflatoxin B1 bioreduction were through (1) binding by the mycelium and (2) by extracellular enzyme. The mold produced five fraction of extracellular enzymes which able to reduce aflatoxin B1. The A fraction showed the highest ability for bioreduction of aflatoxin B1 with specific activity was 0,37 ng aflatoxin B1 / mg enzyme protein/ hours. Heating at 90°C for 10 minutes inactivated the extracelluler enzyme. Beside of the aflatoxin B1 peak, several small peak were observed on the result of HPLC analysis of bioreduction products, but it were not identified. The bioreduction products have no toxic effect by using Bacillus megaterium as an idicator for toxicity test. It was called that extracellular enzyme able to detoxify aflatoxin B1. The IR spectra of bioreduction product was different compare to the IR spectra of aflatoxin B1. The functional groups of C=O; C=C and C-O-C epoxy and difuran group were disappear. The change of functional groups of bioreduction products might cause the loss of their toxicity . The intracellular enzymes of Aspergillus oryzae KKB4 were not effective in reducing aflatoxin B1.

Kata Kunci : Bioreduksi Aflatoksin Beta1, Fermentasi Koji, Jamur Aspergillus, koji, Aspergillus oryzae, proteolytic, biodegradation, detoxification, aflatoxin B1.