Transformasi Beta-1,3-Endoglukanase cDNA kedelai ke dalam tanaman kubis (Brassica oleracea var. capitata L.) dengan perantara Agrobacterium tumefaciens

MANUHARA, Yosephine Sri Wulan, Promotor Prof.Dr. Issirep Sumardi

2005 | Disertasi | S3 Ilmu Biologi

Kubis (Brassica oleracea var. capitata L.) adalah sayuran daun utama yang hidup di dataran tinggi dan merupakan sayuran penting di Indonesia, sehingga peningkatan produksinya mempunyai prospek yang bagus, tetapi peningkatan produksinya dihambat oleh berbagai faktor, terutama penyakit akibat jamur yang menyerang tanaman tersebut. Oleh karena itu transformasi gen ketahanan terhadap penyakit akibat jamur yaitu β-1,3-endoglukanase cDNA kedelai ke dalam tanaman kubis sangat penting untuk mengatasi masalah tersebut. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan regenerasi tanaman kubis secara in vitro sebagai sel target untuk transformasi, efisiensi transformasi, ekspresi β-1,3-endoglukanase cDNA kedelai dan ketahanan terhadap penyakit akibat jamur pada tanaman kubis transforman. Kemampuan regenerasi tanaman kubis secara in vitro diuji dengan cara menanam eksplan hipokotil dan nodus kotiledon kubis dalam medium MS (Murashige and Skoog) dengan berbagai kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh NAA (naphthalene acetic acid) dan BA (benzyl adenin). Transformasi tanaman kubis hibrida ‘Raja’, ‘Grand 11’ dan ‘Green Power’ dilakukan dengan cara menginfeksi eksplan yang telah diprekultur selama dua hari dengan Agrobacterium tumefaciens LBA4404 yang membawa vektor biner pROK1a-EG. Sebagai kontrol positif juga dilakukan transformasi ke dalam daun tembakau. Setelah diinfeksi, eksplan dikokultivasi selama 7 hari dan selanjutnya dipindahkan ke dalam medium seleksi yang mengandung kanamisin 50 mg/l dan sefotaksim 300 mg/l. Eksplan yang mampu membentuk planlet normal pada medium seleksi diuji dengan metode PCR dan hibridisasi dot blot. Untuk mengetahui ekspresi β-1,3-endoglukanase cDNA kedelai dilakukan hibridisasi dot blot terhadap RNA total dari planlet kubis transforman dengan menggunakan pelacak hasil amplifikasi β-1,3-endoglukanase cDNA kedelai. Resistensi planlet kubis transforman diuji dengan cara menginokulasi tanaman kubis transforman dengan jamur Fusarium sp. Hasil penelitian menunjukkan bahwa penggunaan nodus kotiledon sebagai eksplan lebih baik dibanding penggunaan eksplan hipokotil. Efisiensi transformasi pada eksplan nodus kotiledon juga lebih tinggi (10,13%) daripada eksplan hipokotil (1,03%), sedangkan pada kontrol positif (eksplan daun tembakau) diperoleh efisiensi transformasi 27,36%. Keberhasilan transformasi ini juga didukung oleh hasil uji PCR dan hibridisasi dot blot. Hasil analisis ekspresi β-1,3-endoglukanase cDNA kedelai menunjukkan bahwa empat dari tujuh planlet kubis transforman telah berhasil mengekspresikan β-1,3-endoglukanase cDNA kedelai dan dari keempat tanaman kubis transforman hanya satu yang tidak menunjukkan resistensi terhadap infeksi jamur Fusarium sp.

Cabbage (Brassica oleracea var. capitata L.) is one of the main and important upland vegetable in Indonesia, so the improving cabbage production will become a promising prospect. However the increasing cabbage production are inhibited by many factors, especially the fungal disease. The development of fungi tolerant cabbage by introducing soybean β-1,3-endoglucanase cDNA into the cabbage genome is very urgent to overcome the problem. Therefore the objective of this research were to get the target explant to be transformed, transformation efficiency, expression of soybean β- 1,3-endoglucanase cDNA and the resistancy to fungal of the transformed cabbage. Optimation of in vitro regeneration was done by hypocotyls and cotyledonary node explants by planting on MS (Murashige and Skoog) medium with various concentration of growth regulator NAA (naphthalene acetic acid) and BA (benzyladenin). Transformation of soybean β-1,3-endoglucanase cDNA was carried out by infecting the hypocotyls and cotyledonary node explants of ‘Raja’, Grand 11’, ‘Green Power’ cabbage hybrid that have been pre-cultured for two days using Agrobacterium tumefaciens LBA4404 harboring a binary vector containing soybean β- 1,3-endoglucanase cDNA (pROK1a-EG). As a control, tobacco leaf disc was also used in this transformation work. Following the infection, explants were co-cultivated for 7 days and then transferred on a selection medium containing 50 mg/l of kanamycin and 300 mg/l of cefotaxim. Confirmation of transformants were carried out by polymerase chain reaction (PCR) method using a pair of primer correspond to β-1,3-endoglucanase gene and DNA dot blot hybridization. The expression of soybean β-1,3-endoglucanase cDNA was checked by dot blot hybridization of total RNA of recombinant plantlet using amplified soybean β-1,3-endoglucanase cDNA fragment as a probe. Resistancy of the recombinant cabbages were analyzed by inoculating the recombinant plantlets using Fusarium sp. The results showed that cotyledonary nodes were regenerated better than the hypocotyls ones. Transformation efficiency of cotyledonary node was also higher (10.13%) than the hypocotyls explant that was about 1.03%, as indicated by the dot blot hybridization and the PCR results. As a control, transformation efficiency of the tobacco leaf disc was about 27.36%. Analysis of β-1,3-endoglucanase expression demonstrated that four out of seven recombinant cabbage plantlets were able to express transformed gene and from those four recombinant cabbage planltlets, only one plantlet did not showed resistance to Fusarium sp. infection.

Kata Kunci : Transformasi, Beta,1,3, Endoglukanase, cDNA Kedelai.